此方法介绍了染料的红外成像系统的使用H1N1病毒的检测,在细支气管肺泡灌洗(BAL)感染小鼠的高灵敏度流体。这种方法可以在96 – 或384孔板,要求<10μL测试材料的量,并有可能并发多种病原体筛查。
流感病毒是一种呼吸道病原体引起的发病率和死亡率每年在世界多个地区的高度。因此,感染的应变和广大临床标本的快速高通量筛选的准确诊断是至关重要的,以控制流感大流行感染的蔓延。目前流感感染的临床诊断是根据血清学检测,聚合酶链反应,直接试样免疫和细胞培养1,2。
在这里,我们报告了一种新的诊断技术,用于检测活流感病毒的发展。我们用鼠标适应人类A/PR/8/34(PR8,H1N1)病毒3测试使用MDCK细胞4技术的疗效。 (10 4或5×10%以及3)MDCK细胞培养在96 -或使用抗-M2的后面Pr8与病毒蛋白感染的384孔板,检测红外染料共轭秒次级抗体。 M2的5和1血凝素的两个主要标记的蛋白质,用于许多不同的诊断分析。采用红外染料标记的二抗,尽量减少与其他荧光染料相关的自体荧光。使用抗M2抗体,使我们能够使用的病毒数量的直接度量的抗原特异性的荧光强度。要列举的荧光强度,我们采用LI-COR的奥德赛基于红外扫描仪。该系统采用双通道基于激光红外检测到荧光识别和区分他们从背景噪音。第一个通道的激发在680 nm和700 nm的发射,以帮助量化的背景。第二通道检测到780纳米的荧光,激发和发射800纳米。 PR8感染MDCK细胞,在红外扫描仪的扫描表明病毒滴度依赖明亮的荧光。可以连接的荧光强度呈正相关病毒滴度从10 2 -10 5 PFUsistently观察。最小的,但检测阳性持续10 2 -10 3 PFU PR8病毒滴度表明,近红外染料的高灵敏度。通过比较模拟感染或同种抗体治疗MDCK细胞信号信噪比。
我们使用荧光强度 – 从96或384孔板格式,建造标准滴定曲线。在这些计算中,第一个变量是病毒滴度,而第二个变量是荧光强度。因此,我们用指数分布来生成曲线拟合,以确定病毒滴度和荧光强度之间的多项式关系。总的来说,我们得出这样的结论:红外染料为基础的蛋白质检测系统,可以帮助诊断感染病毒株,并精确地列举滴度的感染病原体。
最近的疫情,禽流感在东南亚和全球的猪流感的恐惧强加给公众健康和安全的巨大关注。关键的重点一直致力于为现有的和新的流感病毒株的疫苗。快速精确检测和精确的计算病毒滴度高通量技术的可用性,将极大地提高治疗效果。最常用的技术,计算病毒滴度包括斑块的形成和流感血凝试验。斑块形成实验首次估计噬菌体滴度,,雷纳托杜尔贝科通过计算动物病毒滴度4。若要执行此法,流感的股票或动物标本,如BAL液10倍稀释液准备和MDCK细胞单层接种0.1毫升分装到6孔板。该病毒可以吸附到广告的MDCK细胞dition的营养介质和琼脂糖。孵化期间,原感染的细胞释放子代病毒传播到邻近的细胞。流感病毒感染的细胞病变效应产生的感染细胞的圆形区域,被称为牌匾。每个斑块大概是单细胞与病毒复制的一个单一的病毒粒子感染后形成的。活细胞和斑块之间的对比,可以提高结晶紫等染料。此法的主要缺点是缺乏在实验的重现性和巨大的变化。另一项实验是用来确定流感病毒滴度血凝试验。对流感病毒表面的血凝素蛋白目前有效结合的N-乙酰神经氨酸含蛋白对哺乳动物和鸟类的血红细胞1。这种流感病毒和红细胞之间的相互作用,导致凝集在一个格子的形式。的L的凝集的伊维尔是用来估计在试样的流感病毒的滴度。红细胞凝集试验仅用于确定滴定已知病毒,不能用于菌种鉴定的目的。由于此法不区分活和死病毒,它是很难获得精确的计算病毒滴度。
目前流感感染的临床诊断是根据血清学检测,聚合酶链反应,直接试样免疫和细胞培养1,6。这里所描述的新方法,也有临床和实验室诊断的潜力。流感检测试剂盒Directigen流感(BD公司,圣何塞,加利福尼亚州)和BinaxNow(Binax公司,士嘉堡,ME)使用免疫层析法检测病毒抗原,如核蛋白7。使用这些工具包,病毒检测,在15分钟内就可以实现,但是,所有负样本必须进一步小号creened通过细胞培养方法。各种研究也报道了灵敏度低,这些套件,尤其是当感染轻度或低8。在我们的方法中,我们一贯检测低至100 PFU的病毒。这表明我们的技术检测临床标本中的H1N1病毒是有用的,即使是轻度感染。基于荧光的方法检测病毒抗原据报道,无论是鼻咽分泌物标本进行直接分析或接种到易感细胞病毒增殖和随后的分析9单层。然而,这些方法用于诊断目的的限制,不适合计算病毒滴度。的Q-PCR有助于识别病毒RNA存在,并没有估计活病毒的传染性。红外染料为基础的检测系统相比,这些化验,将有助于在临床和实验室样品的检测和病毒滴度枚举。在流感爆发的情况下,它是关键诊断数以千计的样品,在很短的时间内。我们的方法基于384孔板和红外扫描仪可以扫描时间(> 2000个样品)6板,因此提供了更大的优势超过其他直接荧光方法。快速处理数以千计的临床标本的可行性,可减少检测时间和成本,长度测试变异。 M2特异性抗体的使用提供了独立的H和N蛋白的应变差异的优势。在大多数的流感株感染人类的M2蛋白是相对保守的。如果与我们的系统结合的特异性抗体循环污渍,可以衡量的病毒滴度,并找出应变。然而,由于M2是金刚烷胺类药物的目标,突变可以出现,可能会改变这里使用的单克隆抗体结合位点。这代表了这个系统正在这些药物治疗的个体潜在的局限性。
多种试验样品检测用于枚举流感滴度。计算病毒滴度,50%组织培养感染剂量(TCID 50)和蛋尿囊液的检测,被广泛应用于1,10。然而,多天的要求,使这些方法不可靠。此外,在这些方法上的斑块数量的50%的变化计算提供了理论,但不准确的病毒滴定。斑块形成检测可在96小时内进行;然而,缺乏可重复性是一种病毒滴度计算主要关注的问题。这里描述目前的技术有几个明显的优势。首先,它是一致的结果具有高度重复性的技术。二,病毒滴度计算的基础上对定义的标准曲线相比,荧光强度的简单量化。第三,两个或两个以上的主要抗体,可以用于诊断多种血清型,在给定的样本。此外,红外染料标记的抗体有微量人自体荧光,并已被用于细胞成像11。紫外线或视觉辐射(300-600纳米)的结果,由于存在高量子高产的内源性荧光在高细胞自体荧光。这些措施包括芳香族氨基酸,脂质体颜料,吡啶核苷酸(NADPH),弹力蛋白,胶原蛋白和黄素辅酶。这使得它很难利用这些辐射的来源为探针,以量化的特定蛋白质表达的细胞的内在属性。相比之下,近红外染料激发和发射670-1000纳米之间。许多宿主细胞的分子和多环芳烃不要在此波长激发,由于光散射减少,发出极低的背景荧光。此外,窗口之间的背景和具体的检测,大大提高由于高消光系数的近红外荧光。耐光性,优异的信号噪声比,是非常量化病毒滴度有关。使用的microfluidic商会将通过机器人控制自动化筛选过程,可以让我们轻松测试具有高度传染性的临床标本。因此,利用这些方法在近红外染料的理想和高度可靠的枚举组织样本中的病毒滴度。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是在国立卫生研究院的一部分赠款以R01 A1064826-01,U19青年AI062627-01,NO1-HHSN26600500032C(SM)的支持。我们感谢我们的实验室成员讨论和技术帮助,蒂娜万岁严格审查的手稿。我们想感谢密尔沃基卫生署实验室的戴维·比娜,病毒培养和PCR。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR-biosciences | 9201-01 | |
384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |