אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.
הופעתו של מיקרוסקופיה intravital במודלים ניסיוניים מלריה מכרסם אפשרה התקדמות גדולה לידיעת 1,2 אינטראקציות טפיל-המארח. לפיכך, הדמיה vivo של טפילי מלריה במהלך טרום האריתרוציטים בשלבים חשפו את הכניסה הפעילה של טפילים לתוך בלוטות הלימפה לעור 3, התפתחות מלאה של הטפיל בעור 4, ויצירת merosome hepatocyte הנגזרות להבטיח הגירה שחרורו של merozoites לתוך זרם הדם 5. יתר על כן, התפתחות של טפילים בודדים אריתרוציטים תועד לאחרונה באמצעות הדמיה 4D תיגר התצוגה הנוכחית שלנו על יצוא חלבון מלריה 6. לפיכך, הדמיה intravital השתנה באופן קיצוני דעתנו על אירועי מפתח בפיתוח Plasmodium. למרבה הצער, מחקרים המעבר הדינאמי של טפילי מלריה דרך הטחול, איבר הלימפה העיקריים מותאם להפליא כדי לנקות אדום נגוע בתאים lood חסרים בשל אילוצים טכניים.
שימוש במודל Murine של המלריה Plasmodium yoelii ב Balb / c עכברים, יישמנו הדמיה intravital של הטחול ודיווח על שיפוץ ההפרש של אותה דבקות parasitized של כדוריות דם אדומות (pRBCs) לתאי מחסום המוצא fibroblastic עיסת אדום במהלך זיהום עם לא קטלני טפיל קו P.yoelii 17x בניגוד זיהומים עם קו 17XL P.yoelii טפיל קטלני 7. כדי להגיע למסקנות האלה, מתודולוגיה ספציפית באמצעות תוכנת ImageJ בחינם פותחה כדי לאפשר אפיון של התנועה תלת מימדי מהיר של יחיד pRBCs. התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מאפשר לקבוע, מהירות כיווניות ומגורים זמן של טפילים הטחול, כל הפרמטרים פונה דבקות in vivo. בנוסף, אנו מדווחים על מתודולוגיה כימות זרימת הדם באמצעות מיקרוסקופ intravital ושימוש אונטערשיידferent צביעה סוכני לקבל תובנות לתוך המבנה microcirculatory מורכבת של הטחול.
משפט ואתיקה
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו במתקני חיה של אוניברסיטת ברצלונה בהתאם להנחיות ופרוטוקולים אושרה על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ברצלונה CEEA-UB (פרוטוקול לא DMAH: 5429). נקבה Balb / c עכברים של 6-8 שבועות של גיל התקבלו צ'ארלס ריבר מעבדות.
יישום של מיקרוסקופיה intravital של הטחול במודל זה מלריה מכרסם פתחה את האפשרות לחקור את המעבר הדינאמי של טפילים באמצעות איבר זה שעד עתה נחשב "קופסה שחורה" בשל שיקולים טכניים. כאן, מאמץ גדול הושם להתאים שיטה כמותית המאפשרת ניתוח השוואתי של קווי טפיל שונה ברמות יחיד האו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה במיוחד ס Graewe וו 'Heussler לאימונים הראשוני קלט רציף במיקרוסקופ intravital של טפילי מלריה, כדי ג'יי ברנס על תרומת ה-GFP טפילים מהונדס, א' בוש (יחידת Confocal, CCiT-UB, IDIBAPS) סיוע בניתוח תמונה וכימות ועל פ Astola לקבלת סיוע טכני. אנו מודים tous ר Caralt I. עבור הפקת וידאו. MF הוא מקבל מלגת בוגר בכלליות של קטלוניה. הפ הוא פרופסור מחקר ICREA. עבודה במעבדה של הפ ממומנת על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) מענק לפי הסכם N ° 242095, על ידי קרן פרטית CELLEX (קטלוניה, ספרד), ועל ידי משרד ספרדית למדע וחדשנות ( SAF2009-07760).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |