Summary

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l'évaluation subséquente de la régénération par l'analyse du Mont muscle entier

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour écraser la souris nerf sciatique. Cette méthode utilise facilement disponibles pinces hémostatiques et facilement et de façon reproductible produit complet écrasement du nerf sciatique. En outre, nous décrivons une méthode pour préparer montures de muscles entiers appropriés pour l'analyse de la régénération nerveuse après écrasement du nerf sciatique.

Abstract

La régénération dans le système nerveux périphérique (SNP) est largement étudié à la fois pour sa pertinence à la maladie humaine et de comprendre la réponse robuste régénérative montée par les neurones du SNP ce qui pourrait éclairant les échecs de la régénération du SNC 1. Écrasement du nerf sciatique (axonotmésis) est l'un des modèles les plus courants de lésion du nerf périphérique chez les rongeurs 2. Broyage interrompt tous les axones, mais lames de cellules de Schwann basale sont conservés afin que la régénération est optimal 3,4. Cela permet à l'enquêteur d'étudier précisément la capacité d'un axone en croissance pour interagir avec la cellule de Schwann et lames basales 4. Les rats ont généralement été les modèles animaux préférés pour écrasement du nerf expérimentale. Ils sont largement disponibles et leur sang-froid lésé sciatique fournit une approximation raisonnable de lésions nerveuses humaines 5,4. Bien que plus petit en taille que chez le rat nerf, le nerf de la souris a de nombreuses qualités similaires. Mais surtout, énormemodèles électroniques sont de plus en plus précieux en raison de la grande disponibilité de lignées transgéniques permet maintenant une dissection détaillée des molécules individuelles critiques pour la régénération du nerf 6, 7. Enquêteurs antérieures ont utilisé de multiples méthodes pour produire un écrasement du nerf ou d'une blessure, y compris de simples pinces angulaires, pinces, pinces hémostatiques réfrigérés, pinces vasculaires, et les colliers enquêteur conçus 8,9,10,11,12. Les enquêteurs ont également utilisé diverses méthodes de marquage du site, y compris des blessures de suture, des particules de carbone et de billes fluorescentes 13,14,1. Nous décrivons notre méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique reproductible complète des informations exactes et persistante de marquage de l'écrasement site à l'aide d'une pince fine hémostatiques et de carbone suite à l'écrasement du site de marquage. Dans le cadre de notre description de la procédure écrasement du nerf sciatique, nous avons également inclus une méthode relativement simple de l'ensemble des muscles que nous utilisons pour monter ensuite de quantifier la régénération.

Protocol

1. Expérimentation animale 1,1. Traitement Toutes les procédures d'animaux doit être effectué avec l'approbation de protection des animaux de l'institution locale et Comité d'éthique et conformément à l'utilisation et du Comité et les National Institutes of Health des lignes directrices, avec les mesures prises pour minimiser la douleur et l'inconfort. Nos souris ont été logés dans des conditions contrôlées de température sur un feu de…

Discussion

Nous avons présenté une méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique avec fiabilité complète marquage précis du site d'écrasement. Tel que mentionné précédemment, écrasement du nerf sciatique est un modèle commun de lésion du nerf périphérique chez la souris et les rats. Bien que chaque méthode d'écrasement a ses avantages et ses inconvénients, nous avons trouvé cette méthode produit un écrasement complet qui a été facile de marquer avec un minimum d'équipements spéciaux (p….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH subventions K08NS065157 (à TAF) En outre, le Centre de Penn pour les troubles musculo-squelettiques, P30AR050950 Nombre Prix de l'Institut national de l'arthrite, les maladies musculo-squelettiques et la peau ont soutenu ce travail (TAF et Steven S. Scherer). Enfin, les Shriners de financement pédiatrique semences Research Center (TAF) a soutenu ce travail. Nous tenons à remercier le Dr Young-Jin Fils pour démontrer d'abord toute la montagne procédure et Amy A. Kim pour son aide dans la production des croquis de la figure 1.

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

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Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

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