Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays
Summary
Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.
Abstract
Die Sinnesorgane des Huhns Innenohr werden durch die peripheren Prozesse statoacoustic Ganglion (SAG) Neuronen innerviert. Sinnesorgan Innervation beruht auf einer Kombination von Axon Führung Signale 1 und Überlebensfaktoren 2 entlang der Flugbahn der wachsenden Axone und / oder in ihren Sinnesorgan Ziele entfernt. Zum Beispiel erzeugt funktionelle Störungen mit einem klassischen Axon Führung Signalweg, Semaphorin-Neuropilin, Fehlleitung von otic Axone 3. Auch mehrere Wachstumsfaktoren in den sensorischen Ziele des Innenohrs, darunter Neurotrophin-3 (NT-3) und Brain Derived neurotrophen Faktor (BDNF), ausgedrückt in transgene Tiere manipuliert worden, was wiederum zu der SAG Axone 4 Fehlleitung. Dieselben Moleküle fördern sowohl das Überleben und die Neuritenwachstum chick SAG Neuronen in vitro 5,6.
Hier beschreiben wir und zeigen die In-vitro-Methode, die wir derzeit usingen, um die Reaktionsfähigkeit von chick SAG Neuriten, lösliche Proteine, einschließlich bekannter Morphogene wie die Wnts, sowie Wachstumsfaktoren, die wichtig für die Förderung der SAG Neuritenwachstum und Neuron Überleben zu testen. Mit diesem Modellsystem, hoffen wir Rückschlüsse auf die Effekte, die sezernierte Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum ausüben kann zeichnen.
SAG Explantate an embryonalen Tag 4 (E4) präpariert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen unter serumfreien Bedingungen für 24 Stunden. Erstens ist Neuriten Reaktionsfähigkeit durch Kultivierung Explantate mit Protein-ergänzt Medium getestet. Dann, um zu fragen, ob Punktquellen von sekretierten Liganden können direktionale Effekte auf Neuritenwachstum haben, sind Explantate mit Protein-beschichteten Beads co-kultiviert und untersucht für die Fähigkeit der Raupe vor Ort zu fördern oder hemmen Auswuchs. Wir berücksichtigen auch eine Demonstration der Dissektion (modifizierten Protokoll 7) und die Kultur der E6 Rückenmark Explantate. Wirroutinemäßig Rückenmark Explantate auf Bioaktivität der Proteine und Protein-getränkte Perlen zu bestätigen, und um zu überprüfen Spezies Kreuzreaktivität mit chick Gewebe, unter den gleichen Kulturbedingungen wie SAG Explantate. Diese in-vitro-Assays sind für das schnelle Screening nach Molekülen, die trophische (Überlebensrate) oder tropic (Richt-) Wirkungen auf SAG Neuronen ausüben, insbesondere vor der Durchführung von Studien in vivo bequem. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Prüfung von einzelnen Molekülen unter serumfreien Bedingungen mit hoher Neuron Überleben 8.
Protocol
Discussion
Wir stellen eine Methode zu sezieren und Kultur E4 und E6 SAG Rückenmark Explantate von chick, unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren wird derzeit in unserem Labor verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen sezernierten Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum zu studieren. Neue Aspekte dieses Protokolls sind die Verwendung eines serumfreien System zur Kultivierung von Explantaten und die Verwendung von Perlen in Wachstumsfaktoren getränkt, um Auswirkungen auf die SAG Neuritenwachs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RO1DC002756 und der Purdue Research Foundation finanziert. Wir bedanken uns bei Doris Wu und Chang Wiese für Beratung mit Experimenten und Rodney McPhail für die Hilfe bei Zahlen.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
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| Dissection microscope |
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We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
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| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
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| Dissection Materials |
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| Sylgard© coated petri dish |
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| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
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| E4 and E6 chicken eggs |
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| Chick Ringer’s solution |
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Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
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| Collagen preparation |
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| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
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| Explant culture |
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| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
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| Immunohistochemistry |
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| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
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Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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