Summary

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Published: November 22, 2011
doi:

Summary

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Abstract

Células pulmonares dendríticas (DC) desempenham um papel fundamental na detecção invadindo 1,2 patógenos, bem como no controle de respostas tolerogênico 3 no trato respiratório. Pelo menos três subconjuntos principais de células dendríticas pulmonares têm sido descritas em ratos: DC convencional (CDC) 4, plasmocitóide DC (PDC) 5 e IFN-produzindo assassino DC (IKDC) 6,7. O subconjunto do CDC é o subconjunto DC mais proeminentes no pulmão 8.

O marcador comum conhecida para identificar subgrupos DC CD11c é, um tipo que eu transmembrana integrina (β2), que também é expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B 9. Em alguns tecidos, usando CD11c como um marcador para identificar rato DC é válido, como no baço, onde a maioria das células CD11c + representa o subconjunto do CDC que expressa altos níveis do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II). No entanto, o pulmão é um tecido mais heterogêneo, onde sesubconjuntos lado DC, há uma elevada percentagem de uma população de células distintas que expressa altos níveis de CD11c combate os baixos níveis de MHC-II. Com base na sua caracterização e principalmente em sua expressão de F4/80, um marcador de macrófagos do baço, o CD11c oi MHC-II eis população de células do pulmão foi identificado como macrófagos pulmonares 10 e, mais recentemente, como um precursor potencial DC 11.

Em contraste com o rato pDC, o estudo do papel específico do CDC na resposta imunológica pulmonar tem sido limitado devido à falta de um marcador específico que poderia ajudar no isolamento dessas células. Portanto, neste trabalho, descrevemos um procedimento para isolar altamente purificado do mouse pulmão CDC. O isolamento de subconjuntos pulmonar DC representa uma ferramenta muito útil para obter insights sobre a função destas células em resposta a patógenos respiratórios, bem como fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.

Protocol

1. Perfusão pulmonar e suspensão única célula Euthanize o mouse com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina mistura anestésica (em mg / mouse ketamina 1.8, xilazina 0,19) e sangria pela veia femoral Expor a cavidade torácica, cortando e puxando para trás a pele externa do peritônio. Proceder à abertura do diafragma, cortando a caixa torácica para expor tanto o coração e os pulmões. Perfundir gentilmente os pulmões com uma seringa de 5 ml preenchido com EDTA-HBSS …

Discussion

Isolamento de pulmonar do rato DC é uma técnica importante para o estudo de uma ampla gama de estímulos respiratórios. O processo de obtenção dessas células inclui passos críticos que impedem a perda de células, bem como a viabilidade celular e pureza. Perfusão do pulmão antes da coleta ajudará a eliminar as células periféricas, bem como reduzir os eritrócitos contaminantes. O uso da dissociação automatizado pode ser advanteogus quando um grande número de pulmões são tratados, caso contrário, você …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Marilyn Dietrich no Centro de Núcleo LSU Citometria de Fluxo por sua ajuda com a separação de células e Mottram Peter por sua ajuda com as microfotografias. Este trabalho foi financiado pela Flight Attendant Medical Research Institute, da LSU-Competitiva Prêmio Programa de Pesquisa, e os subsídios NIH / NIAID P20 RR020159 e R03AI081171.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
ACK lysing buffer Invitrogen D6-0005DG  
Anti-mouse CD11c (HL3) BD Pharmingen 5580979 PE-Cy7 conjugated
Anti-mouse I-A/I-E (269) BD-Pharmingen 553623 FITC conjugated
Collangenase Type 1A Sigma 9891-500MG  
Cell strainers BD Falcon 352340, 352360  
CD11c (N418) Microbeads Miltenyi 130-052-001  
DNase I Sigma D5025-150KU  
Hank’s Balanced Salt solution Invitrogen 14170  
Hepes buffer solution Invitrogen 15630  
Petri dishes 60 mm BD Falcon 351016  
GentleMACS™ C tubes Miltenyi 130-093-237  
Gentle MACS dissociator Miltentyi 130-093-235  
AutoMACS-Pro™ Miltenyi 130-092-545  
FASCS Aria BD    

References

  1. Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
  2. Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
  4. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
  5. Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
  6. Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
  7. Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
  8. Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
  9. Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
  10. Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
  11. Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
  12. Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
  13. Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
  14. Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).

Play Video

Cite This Article
Lancelin, W., Guerrero-Plata, A. Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (57), e3563, doi:10.3791/3563 (2011).

View Video