アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産
Summary
ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。
Abstract
例えばラットH-1PVとMVMなどの齧歯類パルボウイルスは、（PV）、小さな正二十面体、一本鎖のDNAウイルスである。それらのゲノムは、それぞれ1非構造（NS1とNS2）とカプシド蛋白（VP1およびVP2）の発現を調節する2つのプロモーターP4とP38が含まれています。人間の2の非病原性でありながら、彼らは腫瘍溶解性とoncosuppressive能力のための抗癌剤として高い関心を集めている。 NS1は、ウイルスの細胞毒性3の主要なエフェクターである。さらに彼らの自然な抗腫瘍活性を高めるために、これらのベクトルからの誘導体は、治療遺伝子（ 例えば、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抑制遺伝子等）4とキャプシド蛋白質をコードする遺伝子を置換することによって生成されました。組換えパルボウイルス（recPVs）ベクターはウイルスDNAの増幅およびパッケージングするために必要なNS1 / 2コード配列とPVゲノムのテロメアを維持します。の生産recPVsはVPタンパク質（ 図1）4をコードする遺伝子を発現する第二のベクター（のpCMV-VP）で細胞を共トランスフェクトすることにより、プロデューサー細胞（一般にHEK293T）でのみ発生します。この方法で生成されたrecPVベクターは、複製欠損である。 recPVsは、それらが生成された元の親ウイルスに対する強化されたoncotoxic活性を有することがわかっていますが、それらの生産が主要な課題であると強く抗がん剤の臨床応用におけるこれらの薬剤の使用を妨げます。
我々は、使用中の他のプロトコルと比較してより10倍recPVsの生産を向上させたHEK293TにE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子（ 例えば pXX6プラスミド）を含むAD-5由来ベクターの導入は見つかりました。この知見に基づいて、我々はrecPVs生産などparvovirを強化するために必要なゲノムのアデノウイルスの要素を含む小説広告-VP-ヘルパーを構築した私達VP遺伝子ユニット5。広告-VP-ヘルパーの使用は、可能な限り（ 例えば NB324K）トランスフェクションが困難な細胞株を利用して、ウイルス感染の手順（のようなプラスミドトランスフェクションとは対照的に）に完全に依存するプロトコルを使用して、REC-PVの生産を可能にする（ 図2）。我々は非常に最終製品の5の品質に影響を与えることなく、生産時間とコストの両方を削減し、産生された組換えウイルスの量を向上させる手法を提案する。さらに、recPVの大規模生産は（浮遊細胞とバイオリアクター）で現在考えられる。
Protocol
Discussion
我々はrecPV生産はアデノウイルスゲノムの要素の存在によって増強することができることを示している。私達はでrecPVとの組み合わせでトランスフェクションを介してアデノウイルスゲノムの要素を提供することによって、およびAd-VP-ヘルパーと100以上の倍の共感染細胞による10以上の倍（0.3から5 TU /セルから）でrecPV収率を増加している従来のプロトコルとの比較。ここで説明するプロトコ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、特定のマーカス·ミュラー、シルビアミュンスターマン、バーバラLiebetrau、とマンディロッシャーで、DKFZウイルスの生産と開発部のチームに感謝しています。本研究では、部分的に教育研究（BMBF）とドイツKrebsforschungszentrum /Cancéropôleデュグランドエスト応用腫瘍ウイルスの共同プログラムの枠組みの中で、ヘルムホルツ協会の連邦省からの補助金によって支えられてきた。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
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