Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.
Detecção e processamento primário de física, química e térmica por estímulos sensoriais periféricos fibras nervosas sensoriais é fundamental para a percepção sensorial em animais e humanos. Essas fibras nervosas sensoriais periféricas expressam um grande número de receptores e proteínas de canais iônicos que detectam e iniciar específicos estímulos sensoriais. Métodos estão disponíveis para caracterizar as propriedades elétricas do periférico as fibras nervosas sensoriais que inervam a pele, que também pode ser utilizado para identificar a expressão funcional de proteínas canal específico de íons nessas fibras. No entanto, similar métodos eletrofisiológicos não estão disponíveis (e também são difíceis de desenvolver) para a detecção da expressão funcional de receptores e proteínas de canais iônicos na periferia fibras nervosas sensoriais que inervam outros órgãos viscerais, incluindo os tecidos mais difíceis como o osso. Além disso, tais métodos eletrofisiológicos não pode ser utilizado para determinar a expressão de proteínas não-excitáveiss em fibras nervosas sensoriais periféricas. Portanto, imunocoloração de amostras de tecido periférico / visceral para Fivers nervosas sensoriais fornece a melhor maneira possível para determinar a expressão de proteínas específicas de interesse nestas fibras nervosas. Até agora, a maioria dos estudos de proteínas expressão em neurônios sensoriais têm utilizado imunocoloração procedimentos em gânglios sensoriais, onde a informação é limitada à expressão de proteínas específicas no corpo da célula de tipos específicos ou subconjuntos de neurônios sensoriais. Aqui relatamos métodos detalhados / protocolos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Nós métodos especificamente detalhe para a preparação da pele ou biópsia plantar e osso (fêmur) seções de camundongos para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Estes métodos não são apenas a chave para a determinação qualitativa de expressão de proteínas em neurônios sensoriais periféricos, mas também fornecem um método quantitativo para ensaiodeterminar alterações nos níveis de proteína expressão em tipos específicos ou subconjuntos de fibras sensoriais, bem como para determinar as mudanças morfológicas e / ou anatômica no número e densidade de fibras sensoriais durante vários estados patológicos. Além disso, estes métodos não estão confinados à coloração de apenas fibras nervosas sensoriais, mas também pode ser usado para a coloração de todos os tipos de fibras nervosas na pele, ossos e tecido visceral outros.
Aqui temos detalhados os métodos para a preparação da pele do rato e seções de tecido ósseo para a imunocoloração e detecção de periféricos fibras nervosas sensoriais. As seções produzido a partir de biópsias plantar soco conter a pele glabra e cabeludo, o que significa que o protocolo pode ser usado em qualquer tipo de pele. Essas técnicas também podem ser empregadas para corar outros tipos de células nesses tecidos (por exemplo leucócitos, endotélio vascular, músculo liso entre outros). Esses méto…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Yuriy M. Usachev por sua ajuda na padronização inicial de microscopia confocal / imagem de imunocoloração do mouse plantar biópsia com punch, e Dr. Donna L. Hammond por sua ajuda contínua e críticas construtivas a este trabalho. Este trabalho foi financiado por concessões do NINDS / NIH (NS069898), e um Idea Award Grant Desenvolvimento do Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) ao DPM
Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
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ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |