γ-Herpesviruses (γ-HVS) устанавливает пожизненное настойчивость в их хозяина. Заражение мышей с γ-HV68 обеспечивает генетически послушный<em> В естественных условиях</em> Модели для характеристики жизненного цикла / патогенезе γHVs. Этот протокол описывает обнаружения и количественного определения γHV68 инфекции при острых и латентных стадиях после заражения бляшкообразующих, инфекционный центр, и КПЦР анализов.
γ-Herpesviruses (γ-HVS) отличаются способностью устанавливать скрытые инфекции лимфоидных клеток 1. Узком диапазоне множество человеческих γ-HVS, таких как ВЭБ и KSHV, серьезно препятствует детальные исследования патогенных. Мышей γ-герпесвирусов 68 (γHV68) акций обширные генетические и биологические сходства с человеческим γ-HVS и является естественным возбудителем мюрид грызунов 2. Таким образом, оценка γHV68 заражение мышей инбредных линий на разных стадиях вирусной инфекции служит важной моделью для понимания вирусной жизненного цикла и патогенез при γ-HVS инфекции.
После прививки интраназально, γHV68 инфекция приводит к острой виремии в легких, который позже решил в латентной инфекции спленоцитов и других клеток, что может быть возобновлен в течение всего срока хост 3,4. В этом протоколе мы опишем, как использовать доску анализа для оценкис инфекционным титром вируса в легких гомогенатах на Веро монослоев ячейки на ранней стадии (5 – 7 дней) после интраназального заражения (точек на дюйм). Хотя острой инфекции в значительной степени очистили 2 – 3 недели postinfection, латентной инфекции из γHV68 установлено около 14 точек на дюйм и поддерживаться в дальнейшем в селезенке мышей. Скрытая инфекция обычно поражает очень небольшой популяции клеток в инфицированных тканях, при этом вирус остается бездействующим и отключает большую часть своей экспрессии генов. Латентно-инфицированных спленоцитов спонтанно активировать вирус на культивирующий в искусственной среде в культуре ткани, которая может быть кратко изложил на инфекционный центр (ИЦ) анализа для определения вирусной нагрузки скрытой. Для дальнейшей оценки количества вирусных копий генома в острой и / или латентно инфицированных тканей, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) используется для его максимальной чувствительности и точности. Комбинированный анализ результатов КПЦР и налета анализа и / или IC анализ покажет пространственно-временные профили вирусногорепликации и инфекционности в естественных условиях.
γHV68 был широко использован в качестве модели для понимания патогенеза человека γ-HVS 2,4,5. В этом протоколе, мы описали три обычно используются методы, в том числе доска тест для инфекционного титра вируса, IC анализ на вирусную нагрузку скрытой, и КПЦР вирусной нагрузки генома, для оц…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы признать, технические консультации и поддержку от Ren Солнца (Университет Калифорнии, Лос-Анджелес) и Seungmin Хван (Вашингтонский университет). Эта работа финансировалась Бакстер Фонд Национальных Институтов Здоровья грантов (R01 и R21 CA140964 AI083841 к C. Liang).
Material Name | Preparation Procedure |
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment