使用左旋多巴的多巴胺替代药物治疗是最常用的对症治疗帕金森氏病,但伴随着不自主的异常运动,被称为运动障碍的副作用,包括<sup> 1</sup>。在这里,协议为MALDI成像质谱检测大鼠脑组织中神经肽水平相关的运动障碍的变化。
MALDI成像质谱(IMS)是一个功能强大的方法,有利于分子物种在生物组织样品2(图1)的空间分析。 12微米的薄组织切片覆盖,这有利于解吸和完整的多肽和蛋白质,可以检测与质量分析仪,通常使用MALDI TOF / TOF质谱仪的电离与电离矩阵。一般几百峰,可以在一个单一的大鼠脑组织切片评估。中常用的成像技术相比,这种方法并不需要先验知识感兴趣的分子,并允许无监督和综合分析多种分子物种,同时保持高的分子特异性和灵敏度2。在这里,我们描述了1电离基于IMS的方法,阐明在动物模型的帕金森氏病(PD)大鼠脑特定区域的神经肽的分布状况。
PD是一种常见的神经退行性疾病与3,4岁以下65人以上的1%的患病率。最常见的对症治疗的基础上多巴胺替代使用左旋多巴5。然而,这是伴随着严重的副作用,包括不自主的异常运动,称为左旋多巴诱发的运动障碍(盖)1,3,6。盖分子的最突出的变化之一是阿片类易制毒化学前强啡肽mRNA的上调。强啡肽调节神经递质在大脑基本上是在运动控制7,8涉及的领域。然而,迄今为止尚未从神经肽前体的加工确切的起源阿片肽特点。因此,我们利用电离的IMS实验帕金森氏症和左旋多巴引起的运动障碍的动物模型。
MALDI成像质谱被证明是特别有利的方面肽characterizaTION,因为常用的抗体为基础的方法,针对已知的多肽序列和先前发现的翻译后修饰。 IMS的电离通过对比可以揭示新型肽加工产品,从而揭示神经肽的神经传输调制的新的分子机制。肽离子的相对丰度,而神经肽的绝对数额不能确定用MALDI IMS,可以划定质谱,提供有关健康和疾病的变化水平的见解。在这里介绍的例子中,被发现的,α-neoendorphin的强啡肽B和P物质的峰强度显着增加在背侧,但不背内侧纹状体的动物有严重运动障碍累及面部,躯干和orolingual肌肉(图5)。此外,IMS的电离透露,运动障碍的严重程度和DES-酪氨酸α-neoendorphin的水平之间的关系,代表的功能inacti的以前未知的机制VATION减少在去除N-端酪氨酸纹状体强啡肽强啡肽的阿片受体结合能力9。这是第一个研究神经表征中使用MALDI IMS和业绩突出的技术在生物医学研究的各个领域的应用潜力的盖子。
有用人中的神经肽的研究MALDI成像质谱仪的几个优势。一个公正的MS数据分析,可以揭示只有特定的脑细胞,或在这里只有纹状体背外侧部分具有一定的病理生理条件的结果。所保留的空间信息,然后就可以重新定义地区的利益,执行更高的灵敏度和较低的变异相比,全脑切片或使用传统peptidomics肽提取物的研究与分析统计分析。此外,重要的是实现电离的IMS随时可以发现以前未知的翻译后修饰,但必须遵循结构分析,以确定确切的氨基酸被修改的位置。
常见的陷阱,在可视化的MALDI IMS数据包括映射的最大峰值强度BL线性光学尺ACK(0%),每节实验系列(图3),而不是所有的部分映射到一个共同的绝对规模,其中100%,是所有路段的最大峰值强度,色彩(100%)(图5) 。后一种方法允许组数据和可视化治疗组之间的差异比较。
电离IMS的分析中的一个主要障碍是分配到特定的质量峰的肽。组织串联质谱有时是可能的,但常常被证明是相当困难的13,14。我们发现一个更传统的方法,包括对强阳离子交换层析,反相LC-MS/MS分析,制备分馏可以用来成功许多神经肽序列,尤其是阿片肽。获得质量好MS / MS谱图,不匹配任何数据库中的条目,使用常用的搜索引擎,如福星,它仍然是并不鲜见。在这些情况下,手从头测序是ONLy选项。最终证明高峰身份可以通过MALDI IMS从相应的基因剔除小鼠的组织切片,但这并不总是可用的或可能的。另一种方法是由西方免疫或免疫组化的例子,来验证结果截然不同的方法。这通常可以包括提高抗体和相当数量的工作,验证新的抗体。
在本议定书提出的总体战略,为大型神经肽的MALDI IMS实验,其中包括几个部分和实验条件进行了优化。该协议已得到优化,尤其是阿片肽,并在未来的研究将有很大的影响,在不同的研究领域包括机制的疼痛和内源性药物成瘾就业。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢汉娜华纳贡献数据的宝贵意见,为图3和乔纳斯贝格斯教授。瑞典研究理事会(格兰特522-2006-6416(马),521-2007-5407(马);“阿克Wiberg基金会”(MA,歼轰),瑞典皇家科学院(硕士,JH)和瑞典化学感谢协会(JH)的财政支持。
1.1 Sample collection and preparation
1.2 Matrix application
1.3 Mass spectrometry
1.4 Data processing
1.5 Neuropeptide identification