Summary

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Published: October 23, 2011
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Abstract

וגינוזיס בקטריאלי (BV) היא תסמונת polymicrobial חוזרת מאופיין בשינוי החיידקים "נורמלי" של לקטובצילוס הנשלטת על החיידקים הנשלט על ידי מספר מינים חיידקי, כולל vaginalis Gardnerella, Atopobium vaginae ועוד 1-3. מצב זה קשור עם מגוון של תוצאות בריאותיות שליליות, כולל איידס רכישת 4, וזה יכול להיות קשה לנהל קלינית 5. יתר על כן, האבחנה של BV הסתמכה על השימוש גראם כתמים של מריחות משטח וגינאלי, כי הם ציונים מספריים על קריטריונים שונים 6,7. בעוד אבחון זה הוא פשוט, לא יקר, מתאים גם משאב מוגבל הגדרות, זה יכול סובלים מבעיות הקשורות פרשנויות סובייקטיביות זה לא נותן פרופיל מפורט של הרכב החיידקים הנרתיק 8. מאמצים אחרונים רצף עמוק חשפו החיידקים עשיר, מגוון עם הנרתיקהבדלים ברורים בין דגימות שנלקחו מאנשים אשר מאובחנים עם BV לעומת אותם אנשים שנחשבים 9,10 נורמלי, אשר הביאה לזיהוי של מספר יעדים פוטנציאליים לאבחון מולקולרי של BV 11,12. מחקרים אלו סיפקו שפע של מידע שימושי, אבל רצף עמוק עדיין לא מעשית כשיטת אבחון בסביבה קלינית. תיארנו לאחרונה שיטה מהירה לאפיון החיידקים בנרתיק במתכונת זמנית באמצעות oligonucleotide מצמידים חרוזי ניאון עם זיהוי על פלטפורמה Luminex 13. שיטה זו, כמו כתם הנוכחי מבוסס שיטות סבתא, היא מהירה ופשוטה אבל מוסיפה את יתרון נוסף של ניצול הידע המולקולרי הנובעים רצף לימודי עיצוב בדיקה. שיטה זו ולכן מספק דרך הפרופיל מיקרואורגניזמים העיקריים נמצאים מקלון הנרתיק שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן BV עם סגוליות גבוהה comp רגישותared כדי גראם כתם תוך מתן מידע נוסף על נוכחות מינים ושפע באופן חצי כמותי ומהיר. שיטה זו זמנית ניתן להרחבה גם מעבר לטווח של PCR כמותי מבחני הנוכחי של אורגניזמים מסוימים, אשר כרגע מוגבל ל 5 או 6 מבחני שונים יחיד מדגם 14. חשוב לציין כי השיטה אינה מוגבלת לזיהוי דגימות של חיידקים בנרתיק ניתן להתאים בקלות במהירות פרופיל כמעט כל הקהילה מיקרוביאלי של עניין. לדוגמה, יש לנו לאחרונה החל ליישם מתודולוגיה לפיתוח של כלי אבחון לשימוש בצמחים וטיפול בשפכים.

Protocol

שיטה זו שימשה במחקר דיווחו Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). תרשים סכמטי המתאר את הליך הכולל מוצג באיור 1. 1. ביד צימוד זה מתאר את שיטות ל…

Discussion

סגוליות של הדור אות היא בעלת חשיבות מכרעת, אתה חייב להיות בטוח כי האות שנצפה באמת משקף את הזיהוי של amplicon שנוצר אורגניזם הזה. תוכנות כגון PrimerPlex (פרמייר Biosoft) יכול לעזור לתכנן בדיקות אשר להכליא ביעילות, אבל הם עשויה או לא עשויה לחצות להכליא ליעד הלא מינים. כאשר אוניברסלי p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים אלברטו Severini וונסה Goleski לעזרה בפיתוח assay והערות קריטי על כתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לבריאות הציבור של קנדה תעשייתי מחקר סיוע התוכנית (המועצה הלאומית למחקר של קנדה). תמיכה נוספת התקבלה מאוניברסיטת הקרן פרסום ססקצ'ואן.

Materials

Oligonucleotide name Company Sequence1
H279BP Invitrogen, IDT, or other Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280 YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613   CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G.

Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) Pierce 22980  
Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) Luminex or Bio-Rad Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors.
Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) Invitrogen, IDT, or other various Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13.
T7 exonuclease New England Biolabs M0263S  
Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) Invitrogen S-866 Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended
Thermowell 96 well PCR plates Fisher CS006509 fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine
Thermowell sealing mat Fisher CS006555 Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry
5M TMAC Sigma T3411  
Bio-Plex or Luminex instrument Bio-Rad or Luminex Bio-Rad : 171-000201  
PrimerPlex software for probe design Premier Biosoft www.premierbiosoft.com Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used

Table 2. Specific reagents and equipment.

component μl/assay μl/100 assays final concentration
10x PCR buffer (Invitrogen) 5 500 1x
50 mM MgCl2 (Invitrogen) 2.5 250 2.5 mM
10 mM dNTP 1 100 0.2 mM each
H279BP, 25 μM 0.25 25 375 nM
H1612BP, 25 μM 0.75 75 125 nM
H280, 25 μM 0.25 25 375 nM
H1613, 25 μM 0.75 75 125 nM
Water 34 3400
Totals 44.5 4450  

Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.

References

  1. Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
  2. Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
  3. Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
  4. Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
  5. Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
  6. Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
  7. Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
  8. Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
  9. Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
  10. Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
  11. Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
  12. Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
  13. Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
  14. Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
  15. Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
  16. Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
  17. Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
  18. Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).

Play Video

Cite This Article
Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).

View Video