RNA izolasyonu için güvenilir bir yöntem<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Fare cecums kurtarıldı açıklanmıştır. Kurtarıldı RNA sonraki qPCR, transkripsiyon profilleme ve RNA Seq deneyler için yeterli nicelik ve nitelik taşımaktadır. Bu teknik diğer bağırsak mikropların RNA izolasyonu için adapte edilebilir.
Lösemili hastalarda, ağır yanık yaraları, veya organ nakli 1 gibi bağışıklık sistemleri ile ev sahipliği yapan önemli bir morbidite ve mortalite Pseudomonas aeruginosa (PA) enfeksiyonları sonucu. PA kan dolaşımı enfeksiyonu geliştirme için yüksek riskli hastalarda, gastrointestinal (Gİ) sistem 2 kolonizasyon için ana rezervuar, ancak mekanizmaları olan asemptomatik kolonize mikrop invaziv, ve genellikle ölümcül PA geçişler, patojen belirsizdir. Daha önce, konağın bağışıklık durumu değişiklikler sırasında bakteriyel gen ekspresyonu değişiklikleri belirlemek amacıyla fareler 3 kolonize cecums yaşayan bakteri hücrelerinin PA mRNA kurtarma in vivo transkripsiyon profili deneyleri yapıldı.
Herhangi bir transkripsiyon profil deneyde olduğu gibi, hız sınırlayıcı adım yeterli miktarda yüksek kaliteli mRNA izolasyonu. Enzimler, moloz, gıda artıkları ve GI kanalda partikül madde bolluğu göz önüne alındığında, RNA izolasyonu meydan yıldırıcı. Burada, biz, güvenilir ve tekrarlanabilir fare GI sistem kurtarıldı bakteriyel RNA izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, PA gastrointestinal kolonizasyon ve nötropeni indüklenen yayılması 4 köklü bir fare modeli kullanmaktadır. PA ile bir kez gastrointestinal kolonizasyon doğruladı, fareler, ötenazi ve çekal içeriğini kurtarıldı ve flash dondurulur. RNA sonra kaynar bozulması, mekanik, fenol / kloroform ekstraksiyon, DNaz tedavi ve afinite kromatografisi bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Miktar ve saflık spektrofotometri (Nanodrop Teknolojileri) ve bioanalyzer (Agilent Technologies) (Şekil 1) tarafından teyit edilir. GI mikrobiyal RNA izolasyonu Bu yöntem yanı sıra diğer bakteri ve mantarlar kolayca adapte edilebilir.
RNA ekstraksiyon yöntemi, burada açıklanan kurtarma için fare GI yolu hasat yüksek kaliteli Pseudomonas aeruginosa toplam RNA yeterli miktarda sağlar . Bu yöntem, P. ile sınırlı değildir aeruginosa ve diğer bakterilerin potansiyel olarak uygulanabilir. Yeterli mikrobik organizmaların bağırsak kurtarma organizmadan organizmaya önemli ölçüde değişecektir. Bizim fare modeli, P. aeruginosa genellikle 5 x 10 7 5 x 10 8 kob / g feçes 4 arasındaki seviyelerde fare gastrointestinal sistem kolonize. Kurtarılan çekal içeriği kabaca 0.5 gram, P. tahmini sayısı olduğundan iki cecums kurtarıldı aeruginosa 5 x 10 7 5 x 10 8 kob arasında. Diğer mikroorganizmaların kullanılması halinde, gastrointestinal kolonizasyon seviyesini doğrulamak ve daha sonra hedeflenen sayıda kob kurtarmak için gerekli cecums sayısını hesaplamak için ihtiyatlı bir davranış olacaktır. Bu özel fare modeli kullanırken, PA ile enfekte olmayan antibiyotik ile tedavi edilen farelerde çekal içeriğini izole edilen RNA ölçülebilir miktarda olduğunu da not etmek önemlidir.
Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal kolonizasyon ve yaygınlaştırma girişimleri P. patogenezinde taklit etmek için fare modeli kanser ve kök hücre nakli yapılan hastaları bakteriyemi aeruginosa . Bu hasta popülasyonunda, ortakçı florasının genellikle antibiyotik veya kemoterapötik tedavi (GI ortakçı floranın antibiyotik tükenmesi gibi) patojen mikropların (örneğin P. aeruginosa ile mono-dernek) aşırı üremesine neden tükenmiş ve bağışıklık baskılanması sonra sonraki yayılması. Bu fare modelinin avantajları ve sınırlamaları zaten daha önce 4 olarak ele alınmıştır . Bu çalışmanın amacı, GI yolu mikrobik total RNA izole etmek için bir metodoloji sunmaktır. Bu protokol, gastrointestinal sistem (yani ortakçı flora etkileşimleri, inflamatuvar barsak hastalığı gibi bakteriyel etkileri) mikrobiyal patogenez diğer yönlerini incelemek diğer fare modelleri kolayca adapte edilebilir.
Bu yöntemin bir avantajı, donma / çözülme, mekanik parçalama (harç / havaneli, homojenizasyon ile ezerek), kaynama, kimyasal ve lizis (örneğin SDS) de dahil olmak üzere birden fazla lizis adımları birleşme olduğunu. Lizis adımları çokluğuna rağmen, bazı mikroorganizmaların (özellikle Gram-pozitif bakteri ve mantar / maya) ilave mekanik bozulması gerekebilir. Sıcak lizis / asit, fenol-kloroform inkübasyon (Adım 3.5), boncuk ek (bakteri ve maya / veya 0.5-0.7 mm 0,1 mm) ve bir sonraki boncuk atan adım sonra, bu organizmalar 9 lyse için yeterli olmalıdır 10
Fare çekum, tekrarlayan soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon (Adım 3,7-3,9) kurtarıldı malzemelerin karmaşık doğası gereği kesinlikle daha aşağı reaksiyonlar için kabul edilebilir RNA kalitesini ve bütünlüğünü sağlamak için gerekli. 3-5 soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon arasında elimine edilir, sulu ve organik fazlar arasında beyaz bir arayüz önce gerekli olabilir. Son olarak, DNaz tedavi (Adım 4) ve RNeasy Temizleme Protokolü (Adım 5) kombinasyonu kirlenmesine neden olan DNA ve mRNA küçük olmayan (5s ve tRNA) kaldırmak için gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu protokol kullanan tarafından kurtarıldı RNA sonraki transkripsiyon profil 3, qPCR (yayımlanmamış), ve RNA Seq (yayımlanmamış) deneyler için yeterli miktar ve kalitede.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe AI62983 (AYK), AI22535 (GPB) tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
Homogenizer | Omni | TM-125 |
Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
DNase | Ambion | AM2238 |
RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |