Summary

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Published: September 02, 2011
doi:

Summary

Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes<em> In vitro</emModelo>. A abordagem pode ser usada com qualquer micróbio que é passível de longo prazo co-cultura.

Abstract

Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) são adaptadas aos humanos bactérias Gram-negativas que podem causar infecções recorrentes e crônica da mucosa respiratória 1, 2. Para estudar os mecanismos pelos quais estes organismos sobrevivem e no interior dos tecidos respiratórios, um modelo no qual sucesso a longo prazo co-cultura de bactérias e células humanas pode ser realizado é necessária. Usamos principal respiratório humano tecidos epiteliais elevado à interface ar-líquido, o modelo EpiAirway (Mattek, Ashland, MA). Estes não são imortalizados, bem diferenciado, 3-dimensional tecidos que contêm tight junctions, células ciliadas e nonciliated, células caliciformes que produzem mucina, e manter a capacidade de produzir citocinas em resposta à infecção.

Este biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos, pode ser usado em uma série de maneiras, o objetivo geral deste método é a realização de longo prazo co-cultura de tecidos EpiAirway com NTHi e quantificar células associadas bactérias e internalizado ao longo do tempo . Assim, a produção de mucina e do perfil de citocinas dos infectados co-culturas pode ser determinada. Esta abordagem melhora a métodos existentes, em que muitos protocolos atuais usam culturas submersas monocamada ou Transwell de células humanas, que não são capazes de suportar as infecções bacterianas durante longos períodos 3. Por exemplo, se um organismo pode replicar na mídia sobrejacente, isso pode resultar em níveis inaceitáveis ​​de citotoxicidade e perda de células do hospedeiro, prendendo o experimento. O modelo EpiAirway permite a caracterização de longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno. Além disso, desde a origem para a EpiAirway é humano normal tráqueo-brônquica células, em vez de uma linha imortalizada, cada um é uma excelente representação do real tecidos do trato respiratório superior humano, tanto na estrutura como na função 4.

Para este método, os tecidos são desmamados EpiAirway off de compostos anti-microbial e anti-fúngicos por 2 dias antes da entrega, e todos os procedimentos são realizados sob condições livre de antibióticos. Isto requer considerações especiais, já que ambas as bactérias e primário tecidos humanos são usados ​​na cabine de segurança biológica mesmo, e são co-cultivadas por longos períodos.

Protocol

1. Preparando o gabinete de biossegurança para os tecidos EpiAirway Vestindo um casaco de laboratório dedicado, com o cabelo amarrado para trás e luvas, iniciar o fluxo laminar. Após 5 minutos, mover todas as ferramentas no armário (pipetadores, dicas, tubos de centrífuga, etc) para um lado, pulverizar o interior do armário de biossegurança ea faixa com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pulverizar o interior limpo novamente com etanol 70% e deixar secar. Mover as ferramentas para o lado …

Discussion

Este método permite a investigação de longo prazo interações patógeno-hospedeiro em um fundo biologicamente relevantes do ensino primário humana tecidos respiratórios na interface ar-líquido. Aqui nós temos utilizado NTHi como o organismo infectante, mas a interação de qualquer bactéria que não apresenta citotoxicidade inaceitáveis ​​ao longo do tempo pode ser quantificado com este método. O modelo EpiAirway também pode ser usado para o estudo de vírus, drogas ou produtos químicos que afetam as vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Patrick Hayden (Mattek) para discussões úteis, e Robert Smith e Libby Perry da Geórgia Health Sciences University por suas habilidades de EM. Este estudo foi financiado pela NIDCD conceder DC010187 de DAD

Materials

Name of reagent Company Catalogue# Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza 17-513Q  
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza 17-515Q  
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek AIR-100-ABF  
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR 82027-406  
Self-sealing sterilization pouches VWR 89140-802  
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

References

  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
  2. Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
  3. Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
  4. Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
  5. Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
  6. Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
  7. Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
  8. Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
  9. Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
  10. Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).

Play Video

Cite This Article
Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

View Video