DT40, модель позвоночных генетической системы, предоставляет мощный инструмент для анализа функции белка. Здесь мы опишем простой метод, который позволяет качественный анализ параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе в DT40 клеток на одном уровне молекулы.
Поддержание стабильности репликации вилка имеет первостепенное значение для деления клеток, чтобы сохранить жизнеспособность и предотвратить болезнь. Процессы, связанные не только обеспечивают верные дублирования генома в условиях эндогенных и экзогенных повреждений ДНК, но и предотвратить нестабильность генома, признанных причинным фактором в развитии опухоли.
Здесь мы описываем простые и экономически эффективные флуоресцентной микроскопии основе метода визуализации репликации ДНК в птичьем B-клеточной линии DT40. Эта клеточная линия представляет собой мощный инструмент для исследования функции белка в естественных условиях на обратной генетики у позвоночных клетки 1. ДНК-волокна флюорографии в DT40 клетки не хватает конкретных генов позволяет выяснить функции этого продукта гена в репликации ДНК и стабильности генома. Традиционные методы анализа динамики репликации вилкой в клетках позвоночных полагаться на измерения общего уровня синтеза ДНК в популяции импульсно-меченых клеток. Это количественный подход и не позволяет для качественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК. В противоположность этому, скорость движения активной вилки можно проследить непосредственно при использовании техники ДНК волокна 2-4. При таком подходе, зарождающегося ДНК обозначена в естественных условиях путем введения галогенированные нуклеотидов (рис. 1А). Впоследствии отдельные волокна растягиваются на предметное стекло микроскопа, и помечены участки репликации ДНК являются витражи со специфическими антителами и визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1б). Начало репликации, а также вилки направленность определяется последовательное использование двух по-разному модифицированные аналоги. Кроме того, двойная маркировка подход позволяет для количественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе, т.е. репликации структур, таких как текущие и застопорился вилки, плотность репликации происхождения, а также вилки окончаний. Наконец, экспериментальная процедура может выполнитьред в течение дня, и требует лишь общие лабораторного оборудования и флуоресцентного микроскопа.
Мы опишем метод, который позволяет для количественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе при одном уровне молекулы. За последние десять лет, различные версии флюорографии техника волокна ДНК были разработаны для визуализации движения отдельных вилки репликации внутри живых клеток. Критическим параметром во всех этих методов является процедура, используемая для достижения наилучшего возможного растяжения ДНК на стеклянных поверхностях обеспечение хорошо разделенных волокна ДНК. Важный шаг к достижению этого является времени инкубации клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа, а также лизис времени. Эти параметры зависят от температуры и воздушного потока в частности лаборатории и должен быть определен эмпирически. Практическая часть эксперимента волокна ДНК, как правило, осуществляется в течение одного дня. Однако последующие приобретения картину и анализ является более трудоемким и требует практики.
Маркировка протокол может быть объявлениеЭптид чтобы ответить на различные научные проблемы: с помощью агента, который препятствует репликации во время второго импульса маркировки мониторов вилка удлинение / сваливания в ответ на репликативной стресса. В этом случае, первая метка не должна быть промыта в качестве второго нуклеотидных добавляется в избытке. Кроме того, препараты, которые препятствуют репликации могут быть использованы в комбинации или просто после добавления первой этикетки. Это требует первая метка и наркотиками должны быть удалены перед вторым нуклеотидных аналогов применяется. Эта процедура позволяет определить значение различных факторов репарации ДНК в репликативной вилке стабильности / восстановления в условиях репликативной стресса (то есть вилкой сваливания и / или коллапс). Примечательно, что более детальный анализ особенностей программы репликации ДНК может быть выполнена с использованием альтернативных подходов, объединяющих ДНК расчесывание и флуоресценции в гибридизация. Это, однако, является технически более сложным и требует expenSIVE оборудования.
Способность качественно и количественно проанализировать сведения о репликации ДНК обеспечивает необходимый инструмент для исследования дефектов в репликации ДНК сама, а также пути, которые подавляют геномной нестабильности, связанные с репликацией вилки. Несомненно, этот анализ будет и далее способствовать, чтобы пролить свет на механизмы репликации опосредованного репарации ДНК, которые позволяют нормальным клеткам реагировать / адаптироваться к изменениям окружающей среды, а также как раковые клетки используют эти механизмы, чтобы противостоять токсичности препаратов ориентации репликации вилки.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Т. Helleday и д-р Э. Петерманн за помощь в волокна техники, а также члены лаборатории за полезные обсуждения. WN поддерживается старшим Международного братства исследований из Ассоциации по исследованию рака и Международной польского комитета Государственного научно-исследовательского гранта (N301 165935).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
Chicken serum | Sigma | C5405 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |