这是一个可视化白细胞粘附到内皮收获压力容器的方法。该技术使研究不同的腔内压力高达200毫米汞柱,从而模拟高血压的病理生理条件下剪切流动的血管粘连。
据报道,约四分之一的人口在世界范围内,高血压和死亡率全球领先的生物医药风险因素。在血管性高血压与血管内皮功能障碍和增加炎症导致动脉粥样硬化和各种疾病,如慢性肾脏病 ,中风3和心力衰竭4国。在血管炎症导致动脉粥样硬化的最初步骤,其中包括通过血管内皮细胞的滚动,圈养,坚持和随后轮回白细胞的粘附级联。招聘和血管内皮细胞白细胞的积累是介导的粘附分子如血管细胞粘附分子-1(VCAM – 1),细胞内的细胞粘附分子1(ICAM – 1)和E -选择以及增加的上调细胞因子和趋化因子的释放和活性氧上调5。,帮助在体外培养的方法,如静态粘附检测,以确定参与细胞-细胞粘附机制以及细胞粘附分子的分析。在以前聘用的方法在体外研究表明,急性血管内皮细胞上的压力增加可导致单核细胞粘附,粘附分子和炎症标志物的上调6然而,在许多体外试验类似,这些研究结果并没有被实时执行生理流动条件下,也与全血。因此, 在体内实验中越来越多地利用在动物模型中表现出血管炎症和斑块的发展。活体显微镜是目前广泛使用的评估白细胞粘附,轧件,迁移和轮回7-9。当上的白细胞内皮细胞粘附在体内研究相结合的压力的影响不太广泛。这样的一个研究探讨动脉生长和重塑,但炎症标志物的流动和剪切的实时效果,只有通过免疫组织化学10评估。在这里,我们提出了一个完好加压的血液,使用全血灌注血管的实时记录白细胞粘附的模型。方法是体外血管腔灌注模型9,使实时分析的白细胞与内皮完整的血管粘合剂相互作用的修改。我们的修改,使操纵的腔内压力高达200毫米汞柱,不仅在生理流动条件,但也压力条件下的研究。虽然压力myography系统此前已证明,观察血管壁和管腔直径11以及血管收缩,这是首次展示实时的白细胞-内皮相互作用。在这里,我们展示了收获大鼠颈总动脉插管至一个定制的流室加上荧光显微镜技术,使用。船只室配有一个大的底部,让一个大口径物镜工作距离短,以形象船只玻璃罩。此外,选定的激动剂和/或拮抗剂可以利用控制细胞粘附的机制,以进一步调查。活体显微镜这种方法的优点包括没有介入微创手术,因此可以得到更高的吞吐量。这种方法也可以使用本地化抑制剂治疗所需的船只,而活体不仅能使全身抑制剂治疗。
这是修改后的的方法来研究实时加压条件下的完整的隔离血管内皮白细胞粘附。单独的血管腔灌注,使一个大小鼠和大鼠血管的促炎症株的快速验证。启用的压力操纵允许动态的细胞间的相互作用,以观察从低到非常高的腔内压力,从而更好地模拟生理和病理条件。血管直径也可以用足够的细胞成像方案,因此剪切流动和速率可确定,因此操作。
凭借其肌动描记能力,放置在洗澡的药理干预添加另一个层面可能的实验条件下,这种模式使机理和信号通路的研究。虽然内皮保护不能在压力操纵证实,对乙酰胆碱和PE的反应,可进行后灌注 9 。
应该指出的是,此设置演示腔内压力的影响,在细胞与细胞之间的相互作用不是搏动性血流量,也不收缩压或舒张压的影响。此外,白细胞粘附的急性压力的变化进行观察时,这种设置可以还利用来看待慢性压力的影响(即增加孵育时间和使用一种慢性压力的动物模型)。斯普拉格Dawley颈总动脉中演示了这一套,但其他菌株和物种可能用于套管大小适当调整。事实上,重要的是要注意动物的年龄和体重的影响船只的大小,因此,设立需要因材施教,为每艘船舶。关闭并仔细解剖结缔组织可以可视化极大地提高白细胞。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是支持的,部分的OIS维多利亚州政府的计划,全国卫生和医学研究理事会澳大利亚计划和项目赠款(JPF千石除尘)和研究生奖学金(四米歇尔)。
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |