Summary

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Published: September 09, 2011
doi:

Summary

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

Abstract

Menschliche γδ T-Zellen erkennen und reagieren auf eine Vielzahl von Stress-induzierte Antigene, wodurch die Entwicklung angeborenen breiten Anti-Tumor-und anti-infektiösen Aktivität. 1 Die Mehrheit der γδ T-Zellen im peripheren Blut haben die Vγ9Vδ2 T-Zell-Rezeptor. Diese Zellen erkennen Antigen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex-unabhängige Art und Weise und zu entwickeln starke zytolytischer und Th1-like Effektor-Funktionen. 1 Darum sind γδ T-Zellen attraktiven Kandidaten Effektorzellen zur Immuntherapie von Krebs. Vγ9Vδ2 T-Zellen zu phosphoantigens wie reagieren (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), die in Bakterien über Isoprenoidbiosynthese synthetisiert wird; 2 und Isopentenylpyrophosphat (IPP), das hergestellt wird in eukaryotischen Zellen durch die Mevalonatweges. 3 In physiologischer Zustand, ist die Erzeugung von IPP in transformierten Zellen nicht ausreichend für die Aktivierung von γδ T-Zellen. Dysregulation des Mevalonat-Weg in Tumorzellen führt zu einer Akkumulation von IPP und γδ T-Zellen-Aktivierung. 3 Weil Aminobisphosphonate (wie Pamidronat oder Zoledronat) hemmen Farnesylpyrophosphat Synthase (FPP), das Enzym wirkt hinter IPP in der Mevalonat-Weg, intrazellulären IPP und sensitibity auf γδ T-Zellen Anerkennung kann therapeutisch durch Aminobisphosphonate erhöht werden. IPP Akkumulation ist weniger effizient in nontransfomred Zellen als Tumorzellen mit einem pharmakologisch relevante Konzentration von Aminobisphosphonate, die es uns ermöglichen Immuntherapie gegen Krebs durch Aktivierung γδ T-Zellen mit Aminobisphosphonate. 4 Interessanterweise, IPP in Monozyten ansammelt, wenn PBMC mit Aminobisphosphonate behandelt werden, weil der effizienten Drogen-Aufnahme durch die Zellen. 5 Monozyten, die IPP zu akkumulieren Antigen-präsentierenden Zellen und stimulieren Vγ9Vδ2 T-Zellen im peripheren Blut. 6 auf diese Mechanismen, entwickelten wir eine Technik, die für eine groß angelegte Ausbau des γδ T-Zell-Kulturen mit Zoledronat und Interleukin -2 (IL-2). 7 Andere Methoden zur Erweiterung der γδ T-Zellen nutzen die synthetische phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) 8 oder 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP). 9 Alle diese Methoden ex ermöglichen vivo Expansion, die sich in einer großen Anzahl von γδ T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie. Allerdings ist nur Zoledronat eine FDA-Zulassung im Handel erhältlichen Reagenz. Zoledronat-expanded γδ T-Zellen-Display CD27 CD45RA Effektor-Memory-Phänotyp und ihre Funktion kann durch IFN-γ Produktion Assay 7 ausgewertet werden.

Protocol

1. Isolierung von PBMC Draw Blut (7,5 bis 8,0 ml) in einen BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin. Die Röhre enthält eine Natrium-Heparin als Antikoagulans und eine Ficoll-Hypaque Dichte Flüssigkeit, plus ein Polyester-Gel-Schranke, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugenröhrchen / Blutprobe bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) in einer horizontalen Rotor (swing-out Kopf) für 20 min bei 1800 x g. Schalten Zentrifuge bremst ab. Nach de…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine effiziente Erweiterung der γδ T-Zellen aus PBMC. γδ T-Zellen aktiviert und durch Zoledronat erweitert und IL-2 entwickeln komplette Effektor-Funktionen, durch die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität wider. Es wurde berichtet, dass die synthetischen phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) und 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP) auch erweitern γδ T-Zellen, jedoch sind sie nicht im Handel erhältlich. Im Gegensatz dazu ist Zoledronat bereits für klinis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Reagent name Company Catalogue number Comments (optional)
ZOMETA Novartis Pharma K. K   zoledronate
PROLEUKIN Novartis Pharmaceuticals   human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD 362753  
RPMI1640 Invitrogen 21870-076  
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7  
OpTmizer Invitrogen 0080022SA  
brefeldin A Sigma B5936-200UL  
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1MG  
ionomycin Sigma 13909-1ML  
IntraPrep BECKMAN COULTER A07803  
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07746 FITC
A07749 PE/Cy5
 
anti-human CD4-ECD BECKMAN COULTER 6604727  
anti-human CD8-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607011  
anti-human CD14-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07765  
anti-human CD19-PE BECKMAN COULTER A07769  
anti-human CD45-ECD BECKMAN COULTER A07784  
anti-human CD56-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07789  
anti-human TCRαβ-PE BECKMAN COULTER A39499  
anti-human TCR Vγ9-FITC BECKMAN COULTER IM1463  
anti-human CD27-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607107  
anti-human CD45RA-ECD BECKMAN COULTER IM2711  
anti-human CD69-PE BD 555531  
anti-human NKG2D-PE BECKMAN COULTER A08934  
Anti-humal IFNγ-PE BECKMAN COULTER IM2717U  
Mouse IgG1 isotype control-PE BECKMAN COULTER A07796  
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07797 A07798  

References

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Cite This Article
Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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