Colorazione degli anticorpi della<em> Drosophila</em> Pupe può migliorare analisi genetiche di adulti addominale genetica dello sviluppo. Vi presentiamo il nostro protocollo per la colorazione dissezione, la fissazione di anticorpi e di messa in scena<em> Drosophila</em> Addome pupa.
L'addome Drosophila pupa è un sistema modello stabilito per lo studio della morfogenesi epiteliale e lo sviluppo di dimorfismo sessuale morfologie 1-3. Durante impupamento, che si estende su circa 96 ore (a 25 ° C), le popolazioni di cellule proliferanti immaginale sostituire l'epidermide larvale per generare i segmenti addominali adulto. Queste cellule immaginale, nato durante l'embriogenesi, esistono come coppie di laterali di nidi histoblast in ogni segmento addominale delle larve. Quattro paia di nidi histoblast dar luogo alla cuticola adulti dorsale (nidi dorsale anteriore e posteriore), la cuticola ventrale (nidi ventrale) e gli spiracoli associati a ciascun segmento (nidi spiraglio) 4. Su puparation, queste cellule diploidi (distinguibili in base alle dimensioni dal più grande poliploidi larvale cellule epidermiche-LEC) avviare un processo stereotipata di proliferazione, migrazione e sostituzione del LEC. Vari strumenti molecolari e genetici possono essere utilizzati per indagare i contributi di percorsi genetici coinvolti nella morfogenesi del ventre adulto. Fenotipi adulti finale sono tipicamente analizzati i seguenti dissezione degli adulti cuticole addominale. Tuttavia, dall'indagine dei processi molecolari alla base richiede analisi immunoistochimica dell'epitelio pupa, che presentano sfide particolari. Temporalmente morfogenesi dinamica e le interazioni di due popolazioni distinte epiteliali (larvale e immaginale) generano un tessuto fragile, soggetta a perdita di cellule eccessiva durante la dissezione e l'elaborazione successiva. Abbiamo sviluppato metodi di dissezione, fissazione, montaggio e imaging del abdominem epitelio Drosophila pupa per gli studi immunoistochimici che generano coerente campioni di alta qualità adatto per un microscopio confocale o fluorescenti.
Le tecniche presentate in questo video può essere utilizzato per preparare Drosophila pupe da una varietà di punti di tempo dello sviluppo. Pupe lavorato durante il periodo di 24 ore a 32 ore APF APF sono più inclini alla perdita delle cellule dell'epitelio. L'uso di detergenti (come il Triton X-100 e Tween-20) durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la probabilità di perdita di cellule e non è pertanto raccomandato. Piuttosto, l'acido desossicolico è usato come detergente durante la fase iniziale di fissazione. Tutti i passaggi successivi sono eseguiti in PBS 1X senza detersivo. Inoltre, a dondolo campioni durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la perdita di cellule e deve essere evitato.
I campioni possono essere esposte utilizzando tecniche di microscopia confocale. Tuttavia, Drosophila pupe trattati come descritto può essere ripreso con un articolato sistema di microscopia illuminazione cedendo qualità d'immagine paragonabile a tecniche confocale.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation.