Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die overeenkomt met het doel allel.
De huidige commerciële PCR's test voor het identificeren van Salmonella doelwitgenen uniek is voor dit geslacht. Echter, er zijn twee soorten, zes ondersoorten, en meer dan 2.500 verschillende Salmonella serovars, en niet allemaal gelijk zijn in hun betekenis voor de volksgezondheid. Bijvoorbeeld, het vinden van S. enterica subspecies IIIa Arizona op een tafel ei laag boerderij is onbeduidend in vergelijking met de isolatie van S. enterica serovar Enteritidis Ik ondersoort, de belangrijkste oorzaak van salmonellose gekoppeld aan de consumptie van eieren. Serovars zijn geïdentificeerd op basis van antigene verschillen in lipopolysaccharide (LPS) (O antigen) en flagelline (H1 en H2 antigenen). Deze antigene verschillen zijn het uiterlijk van de diversiteit van genen en gen-allelen in verband met dit fenotype.
We hebben een allelotyping, multiplex PCR die toetsen op genetische verschillen tussen de vier grote S. enterica subspecies Ik serovars gevonden in pluimvee en gepaard met een significante menselijke ziekten in de VS. De PCR-primer paren werden gericht op de belangrijkste genen of sequenties die uniek zijn voor een specifieke Salmonella serovar en ontworpen om een amplicon met een grootte van specifiek voor dat gen of allel te produceren. Salmonella serovar wordt toegewezen aan een isoleren gebaseerd op de combinatie van de PCR-test resultaten voor specifieke LPS en flagelline gen allelen. De multiplex PCR's beschreven in dit artikel zijn specifiek voor de detectie van S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium.
Hier laten we zien hoe het multiplex PCR's te gebruiken om serovar te identificeren voor een Salmonella te isoleren.
De meeste commercieel beschikbare PCR-tests voor de opsporing van Salmonella doelen genen die uniek zijn voor het geslacht (ex. Inva). Echter, niet alle Salmonella zijn gelijk in hun vermogen om ziekte te veroorzaken bij de mens of prevalentie in dierpopulaties. Vroegtijdige herkenning van antigene verschillen in Salmonella LPS O-antigeen en flagellinH1 en H2-antigenen heeft geleid tot de differentiatie van Salmonella in meer dan 2500 serovars op basis van deze antigene verschillen. Er zijn 46 verschillende O-antigenen en 86 verschillende flagelline (H) antigenen die in het geslacht Salmonella. Salmonella kan een (H1) of twee verschillende (H1 & H2) flagellins bezitten. De verschillende combinatie van O, H1, H2 en antigenen account voor de 2500 Salmonella serovars erkend. Een serovar is toegewezen op basis van de antigene formule afgeleid van de identificatie van de individuele O-en H-antigenen. De antigene formule wordt geschreven als O: H1: H2; en waar "-", verwijst naar de afwezigheid van H1 of H2 flagelline en "NT" (niet-typeerbare) voor Salmonella negatief voor de O-antigeen. Zo is bijvoorbeeld de serovar Typhimurium toegewezen aan een S. enterica isoleren met de antigene formule B: i: 1,2, terwijl Enteritidis is gegeven aan een te isoleren met de formule D1: g, m: -. Deze antigene variatie in de populatie Salmonella is de uiterlijke manifestatie van verschillen op de nucleotide niveau dat dus gemakkelijk kan worden uitgebuit door PCR.
We hebben de genetische verschillen die verband houden met specifieke O-en H-allelen voor een allelotyping PCR voor het identificeren van S. te ontwikkelen enterica serovars: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium (3). De juiste opdracht en rapportage van Salmonella serovar vereist dat het testen op alle allelen geassocieerd met O: H1: H2 antigene formules voor Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), en Typhimurium (B: i: 1,2). Zonder kennis van de O-allel of antigeen, het vinden van de H1 g, is m allel alleen niet per se identificeren van de Salmonella Enteritidis isoleren als andere Salmonella serovars: Agona, Californië, en Montevideo, ook over deze zelfde allel. Terwijl de allelotyping PCR werd oorspronkelijk ontworpen om te detecteren op de voorgrond genoemde Salmonella serovars, kan deze test identificeren een extra 19 serovars (tabel 3). Onze allelotyping PCR werd oorspronkelijk ontworpen om O-en H-allelen op te sporen. In de praktijk is het meer praktisch en kosteneffectief voor ons om het O-antigeen te identificeren door slide agglutinatie test, met behulp van O-specifieke antisera, in plaats van het uitvoeren van de O allelotyping PCR bij het werken met geïsoleerde Salmonella culturen. Echter, we raden het gebruik van de O allelotyping PCR als je lab gebruikt deze PCR als een scherm (2) of voor het typen van Salmonella-isolaten ingediend FTA-kaarten (6), en omvatten een Salmonella-specifieke PCR met het eerste scherm van de monsters (4 ). Beperk de allelotyping PCR's om alleen die monsters die als Salmonella geïdentificeerd door PCR of biochemische / antigene testen.
Het protocol wordt beschreven in dit artikel is geoptimaliseerd voor gebruik met de Idaho Technology Rapidcycler, een hete-lucht thermocycler die het mogelijk maakt om de schaal van een reactie volumes en loopt reactie-omstandigheden in minder tijd dan veel verwarmingsblok thermocyclers. Aan te passen dit protocol voor gebruik met een verwarmingsblok thermocycler kan verlangen het optimaliseren van reactie-omstandigheden empirisch door het verlagen / verhogen gloeien temperaturen; te passen primer concentraties; of het aanpassen van MgCl 2 concentraties. Zo hebben we het protocol aan te passen voor de MJ Research PTC-200 thermocycler als volgt. Werken met dezelfde reactie volumes beschreven in tabel 1, van de werkvoorraad concentrationof de i primer set werd verdund tot 2,5 uM, was de annealing temperatuur verlaagd van 55 ° C tot 45 ° C, en incubatie tijden op de denaturatie, annealing en extensie stappen werd verlengd tot 20 s voor de i / g, m allelotyping PCR. Na de positieve en negatieve controles zijn essentieel in de eerste opstart en optimalisatie voor een PCR, met inbegrip van gepubliceerde protocollen. We raden aan het verwerven van bekende Salmonella serovars, in het bijzonder Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) en Typhimurium (B: i: 1,2), en een laboratorium Escherichia coli K12 stam (DH5a, LE393, JM109, etc. ) als positieve en negatieve controles respectievelijk voor de allelotyping PCR-testen beschreven in dit artikel. Verschillende van deze Salmonella serovars zal dienen als positief of negatief controles, afhankelijk van welk allel is getest.
Bepaalde voorzorgsmaatregelen en richtlijnen moeten worden gevolgd tijdens het uitvoeren van deze en eventuele andere diagnostische PCR. Ten eerste, de fysieke scheidingvan template voorbereiding, PCR set-up, en gelelektroforese is van cruciaal belang in het voorkomen van mogelijk PCR-carry-over besmetting en onjuiste rapportage van vals-positieven. Daarnaast is het opnemen van passende controles is nodig in een routine PCR zoals deze controles problemen op te sporen als ze zich voordoen en helpen bij de interpretatie van resultaten (5). Het belangrijkste is, consistentie is essentieel, in het bijzonder met betrekking tot de elektroforetische voorwaarden voor amplicon (PCR product) detectie andestimation van amplicongrootte. Ter illustratie van dit punt, we doelbewust opgeschort elektroforese eerder dan de bedoeling is in figuur 1A. Het molecuulgewicht normen (lanen 1 en 13) en de positieve controle (laan 2) zijn niet voldoende van elkaar gescheiden nauwkeurig schatten maten of scheiding van DNA-fragmenten waar er kleine verschillen (~ 50 bp) in de maten te nemen. Adequate scheiding van DNA-fragmenten, in het bijzonder het moleculair gewicht normen essentieel is voor het rapporteren positives is afhankelijk van een nauwkeurige schatting van amplicongrootte en onderscheidende "echt positief" van niet-specifieke amplicons die soms worden waargenomen in de dagelijkse gang van PCR (5 ). Bijvoorbeeld, er is een niet-specifieke amplicon in figuur 1B, baan 7 (~ 700 bp in grootte). Was elektroforese is te vroeg gestopt, toen de kleurstof front was alleen op de manier waarop half punt in de agarose gel, zou er weinig verschil tussen de 500 bp en 700 bp DNA-fragmenten. Daarom zou steekproef in baan 7 ten onrechte zijn gemeld als positief voor zowel de i en g, m allelen.
Tot slot, moet men erkennen de beperkingen verbonden aan een test. Een aantal van de H1/H2 allelotyping PCR hebben niet de macht om discriminerende subtiele genetische verschillen in de allelen die behoren tot de H2 1,2 onderscheiden; 1,5; 1,6, 1,7 antigen complex, e, n, x / e , n, Z15 antigen complex en de H1 G-antigen complex, dat de g, m allel omvat. Een of twee aminozuur veranderingen rekening voor de verschillende epitopen aanwezig in deze flagellaire antigenen. Daarom was het moeilijk voor ons om primers die kunnen misbruiken deze soms enkel basepaar verschillen in de flagelline gensequentie (3) te ontwerpen. Bijvoorbeeld, Salmonella serovars Dublin (D1: g, p: -) en Berta (D1: f, g, t: -) zijn ook positieve PCR met onze g, mallelotyping primers. De H2 allelotyping primers kunnen geen onderscheid maken Typhimurium (B: i: 1,2) van Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) uit Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), of Remo (B: r: 1,7), of Hadar (C2: Z10: e, n, x) uit Glostrup (C2: Z10: e, n, Z15). Terwijl de kans op tegenkomen sommige van deze serovars: Lagos, Bradford, Winneba, Remo of Glustrup is afgelegen, het is een mogelijkheid en vereist, hetzij het verstrekken van disclaimer op de tests 'beperking of een andere bevestigende test.
Kortom, deze PCR-gebaseerde serotypering identificeert snel S. enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg en Typhimurium, en O, H1, H2 en allelen geassocieerd met 19 extra serovars. Deze test is een snelle, kosteneffectief alternatief voor traditionele microbiologische benadering van serotypering Salmonella.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door USDA Grants 1999-35212-8680, 2,005 tot 01,378, en 2010-04288-01, USDA Formule fondsen en de Staat der Diergeneeskunde van Georgië Agricultural Research Grant. Het protocol wordt beschreven in deze publicatie is ontwikkeld voor gebruik door studenten als onderdeel van gericht onderzoek cursussen: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L, en BIOL 4960H aan de Universiteit van Georgia en gebruikt door de studenten op verschillende moleculaire epidemiologie onderzoeksprojecten in de Maurer laboratorium. We willen de vele studenten die onderzoek hebben uitgevoerd in Maurer en Lee laboratoria, en onze afdeling stoel, John Glisson bedanken voor de ondersteuning van onze inspanningen om undergraduate onderwijs te integreren met onderzoek.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Luria Bertani | Fisher | (or any comparable source) | ||
Microfuge tubes | 1.5 ml capacity | Fisher | (or any comparable source) | |
Ethanol | 200 proof | Fisher | (or any comparable source) | |
dH2O | Molecular Biology Grade | Sigma | (or any comparable source; PCR only) | |
10 x PCR Buffer: | 20 mM MgCl2 | Idaho Technology | (buffer comes with BSA, Ficoll and Tartrazine) | |
30 mM MgCl2 | ||||
40 mM MgCl2 | ||||
PCR primers | ||||
DMSO | ||||
dNTP | Roche | (or any comparable source) | ||
Taq DNA Polymerase | Denville | (or any comparable source) | ||
Capillary pipettes | 10 μl volume | Idaho Technology | ||
Rapid Cycler | Idaho Technology | |||
Agarose | Low EEO; Molecular Biology Grade | BioRad | (or any comparable source) | |
50 X TAE Buffer or 5X TBE Buffer | Fisher | (or any comparable source) | ||
Ethidium bromide | BioRad | (or any comparable source) | ||
Horizontal, submersible gel electrophoresis chamber with gel mold | BioRad | (or any comparable source) | ||
Power supply | BioRad | (or any comparable source) | ||
Molecular Imager Gel Doc System | BioRad | (or any comparable source) |
Table 4. Materials