الجذام ، والناجمة عن<em> المتفطرة الجذامية</em> ، لا يزال المرض متوطنا في أماكن كثيرة. من أجل معرفة المزيد عن انتشار وطريقة انتقال مرض الجذام ، فمن المهم لتحديد سلالة<em> م. الجذامية</emأصاب> المريض. عدد متغير من يكرر بالترادف (VNTR) كتابة وأسلوب واحد من هذا القبيل.
دراسة انتقال الجذام أمر صعب بصفة خاصة منذ عامل المسبب للمرض ، المتفطرة الجذامية ، لا يمكن تربيتها في المختبر. المصدر الوحيد للبكتيريا ومرضى الجذام ، والمدرع المصابة تجريبيا والفئران عارية. وبالتالي ، فإن العديد من الأساليب المستخدمة في علم الأوبئة الحديثة ليست متاحة لدراسة مرض الجذام. على الرغم من عالمية واسعة النطاق للمخدرات برنامج العلاج لمرض الجذام التي تنفذها منظمة الصحة العالمية 1 ، يظل الجذام متوطن في كثير من البلدان مع ما يقرب من 250000 حالة جديدة كل عام. (2) M. كامل الجذامية تم تعيين الجينوم 3،4 وتم تحديد مواضع كثيرة وكرر شرائح أزواج القاعدة 2 أو أكثر (تسمى الصغرى وminisatellites) 5 سلالات السريرية م. قد تختلف الجذامية في عدد من القطاعات جنبا إلى جنب المتكرر (يكرر بالترادف قصيرة ، STR) في العديد من هذه المكاني. استخدمت جنبا إلى جنب 5،6،7 متغير عدد تكرار (VNTR) 5 تحليل للتمييز بين سلالات مختلفة من عصيات الجذام. بعض مواضع تبدو أكثر استقرارا من غيرها ، والتي تبين الاختلاف في الأرقام أقل أكرر ، في حين أن آخرين يبدو أن التغيير بسرعة أكبر ، وأحيانا في نفس المريض. في حين أن تقلب VNTRs معينة قد نشأت أسئلة تتعلق ملاءمتها لكتابة سلالة 7،8،9 ، فإن البيانات تشير إلى أن تحليل الناشئة مواضع متعددة ، والتي تتنوع في استقرارها ، ويمكن استخدامها كأداة الوبائية القيمة. وقد استخدمت عدة VNTR موضع التحليل (MLVA) 10 لدراسة تطور وانتقال مرض الجذام في عدة بلدان منها الصين 11،12 ، وملاوي 8 ، 10،13 الفلبين ، والبرازيل 14. MLVA ينطوي على خطوات متعددة. أولا ، يتم استخراج الحمض النووي DNA الجرثومي مع الأنسجة السريرية المضيف الخزعات أو شق الجلد مسحات (SSS). تتضخم ثم 10 والمكاني المطلوب من الحمض النووي المستخرج من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وتستخدم أجهزة الاشعال Fluorescently المسمى لمواضع مختلفة 4-5 في رد الفعل ، حيث يجري تضخيم 18 في مواضع ما مجموعه أربعة ردود الفعل ، ولا يجوز إخضاع 10 المنتجات PCR لهلام إستشراد agarose للتحقق من وجود شرائح الحمض النووي المطلوب ، ومن ثم المقدمة لتحليل طول جزء فلوري (FLA) باستخدام الكهربائي الشعري. passaged الحمض النووي من المدرع البكتيريا المعروفة مع عدد من النسخ لتكرار كل مكان يستخدم كعنصر تحكم إيجابية. ويتم فحص ثم chromatograms FLA الذروة باستخدام الماسح الضوئي وبرامج يتم تحويل جزء من طول عدد النسخ VNTR (أليل). أخيرا ، يتم تحليل VNTR النسخ المتنوعة لأنماط ، ويمكن استخدامها عند دمجها مع البيانات السريرية المريض لتتبع توزيع أنواع التوتر.
جمع عينات من الجلد من مرضى الجذام يتطلب مهارة الأطباء أو الفنيين العاملين في عيادات الجلد. يجب التعامل مع العاملين في المختبرات هذه العينات الحرص على ارتداء المعاطف مختبر ، وقفازات واقية وارتداء العين والعمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية عند التعامل مع عينات من الأنسجة المصابة أو الإنسان المدرع. تطهير الأسطح والأدوات هي أيضا حرجة. العمل في بيئة نظيفة ، ومجلس الوزراء الحيوي المهم آمنة معقمة لتجنب تلوث عينات من الحمض النووي.
وقد أصبح استخراج الحمض النووي من السهل نسبيا بفضل لتطوير استخراج مجموعات من شركات مثل Qiagen. يجب أن يتبع توجيهات بعناية. يجب أن تبقى جميع العينات الباردة عندما لا تكون قيد الاستعمال. تجنب تكرار ، والتغيرات في درجة الحرارة القصوى للعينات.
ويمكن طلب الاشعال DNA المستخدمة في هذا العمل من مختلف الشركات التي قد ورد ذكرها في قائمة المراجع الأدب في نهاية هذه الورقة. وينبغي الحرص على العمل مع أجهزة الاشعال في بيئة حرة في الحمض النووي لتجنب التلوث. الاشعال يأتي على شكل مسحوق جاف ، ويجب أن تكون مختلطة مع الشركة المصرية للاتصالات والمخففة لتركيز 100μM ، ثم فصل في كميات صغيرة (الشكل 2A). مزيد من الحلول المخففة هي عمل الاشعال لتركيزات 10μM. مرة أخرى ، لا تستخدم عينات من الحمض النووي في مناطق / اغطية التي تستخدم فيها أجهزة الاشعال والمعدة.
وينبغي أيضا أن تظل المنتجات PCR الباردة عندما لا تكون قيد الاستعمال.
وهناك 3 ٪ تحضير هلام agarose إعطاء أفضل فصل الفرقة الحمض النووي ، ولكنه يأخذ وقتا أطول لتشغيل. النوعي لأغراض محض ، 2 ٪ لا يكفي عادة. إيثيديوم حل بروميد تستخدم لتلوين الحمض النووي في الهلام هو agarose genotoxin نشطة للغاية أن يمتص من خلال الجلد. التعامل مع هذا الحل والمواد الهلامية ملطخة باستخدام عناية كبيرة ويجري دائما تأكد من ارتداء القفازات. غسل اليدين جيدا بعد التعامل مع عينات الحمض النووي أو أي مواد بروميد إيثيديوم. التخلص من بروميد إيثيديوم حل تلطيخ والغسيل والمواد الهلامية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. لا الهلام المطلوبة بشكل روتيني ، ويمكن القضاء على هذه الخطوة مرة واحدة وضعت أساليب FLA. حان الوقت والمستهلكة كاشف.
الحل formamide المستخدمة في إعداد العينات للFLA أيضا سامة للغاية وينبغي التعامل معها بحذر. غسل اليدين بعد الاستخدام. التخلص منها المبادئ التوجيهية التالية المؤسسية.
ويمكن قراءة نتائج FLA الذروة باستخدام برنامج ماسح أمرا صعبا. وقد وضعت مجموعة أساسية من المكالمات أليل (عدد يكرر جنبا إلى جنب) في CSU (الجداول 4-7). (وتجدر الإشارة إلى أن الجداول 4-07 مايو لا يكون شاملة وكما غيرها من سلالات M. الجذامية يتم دراستها ، ويمكن الاطلاع على نسخة الأليلات مع الأرقام خارج النطاقات المذكورة.) واحد تحديا خاصا يتضمن "تلعثم" القمم. هذه هي الحدود القصوى للعائلات ، وخصوصا من تقارير المعاملات المشبوهة التي تنطوي فقط 2-3 يكرر الزوج القاعدة ، مثل (TA) 10. اختيار أحيانا ذروة الصحيح لقراءة صعبة (الشكل 7). في هذا الشكل ، والذروة في السيطرة الإيجابية في غليان 190 هو ذروة الرئيسية. انخفاض يصل إلى ذروته في الارتفاع التي هي 2 أو 4 أو 6 أزواج حتى قاعدة أكبر أو أصغر من ذروة رئيسية تسمى "قمم تلعثم". يمكن A – المخلفات أيضا أن يسبب الارتباك. وصفت في وقت سابق من A – المخلفات في النص والشكل 8. أخيرا ، إذا كانت منتجات وفيرة للغاية PCR في العينات ، قد تظهر مع القمم ارتفاعا مزدوجة. في هذه الحالة ، وقراءة في مركز شكل الذروة. (انظر الشكل 6 ، 6 مرضى).
إدارة البيانات يمكن أن تكون مهمة هائلة لهذا النوع من العمل. فمن المهم لتسجيل جميع المعلومات ذات الصلة لجميع التجارب مثل : تاريخ المهمة أو الداخلي ، المشغل ، الشريط / لوحة خرائط وأوامر FLA ، وظروف PCR وصفات ، وتواريخ المواد الهلامية والصور الفوتوغرافية ، ودرجات حرارة التخزين ، والتخفيفات قالب الحمض النووي ، FLA مواقع إلكترونية يمكن تخزين الملفات ، الخ. تنظيم جيد وإدارة البيانات تنقذ ساعة من الوقت الذي يقضيه يبحث عن قطعة معينة من المعلومات في المستقبل.
وقد عمل المختبر الموصوفة هنا يحدث لعدة سنوات في جامعة ولاية كولورادو وغيرها من المواقع في جميع أنحاء العالم. صورة كبيرة مما كافة البيانات التي تم جمعها الوسائل والكيفية التي يمكن من استخدامها في المستقبل بدأت في الظهور. أرقام 10A 10B وتوضح كيف يمكن استخدام هذه البصمات الحمض النووي للتمييز بين مختلف م. سلالات الجذامية بين البلدان (10A) ، أو حتى بين العائلات (10B). وقد تبين أن الأسرة والمجتمع الحالات مرتبطة تحمل M. الجذامية متشابهة أو متطابقة من أنواع الضغط VNTR. الأمل هو أنه قد يكون من الممكن الحصول على مزيد من التبصر في وضع (ق) من انتقال مرض الجذام بحيث يمكن تطويرها لنظام الكشف المبكر عن شبكات النقل لهؤلاء الناس موسقد ر المعرضين للخطر ، والعلاج بالعقاقير العلاجية التي تبدأ قبل انجاز تلف دائم العصبية والجلدية.
The authors have nothing to disclose.
وقدم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة / NIAID منح RO1 – AI – 63457 الأذربيجانية ومنح تكملة RO1 – AI – 63457 S1. نعترف مساهمات جميع الأعضاء الحاليين والسابقين للفريق المختبر والمتعاونين معهم.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
Multiplex PCR Kit | Qiagen | 206143 | |
DNA Primers | Various | ||
Agarose Gel | Various | ||
5x or 6x Gel Loading Buffer | New England Biolabs | B7021S | Recipes available to make your own* |
Ethidium Bromide solution | Various | Dilute from con. | |
Hi-Di Formamide Solution | Applied BioSystems | 4311320 | |
Gene Scan -500 LIZ | Applied BioSystems | 4322682 |
* http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html
Equipment | Comments |
---|---|
2 Refrigerators | 4°C: 1 for DNA samples, 1 for primers and Multiplex reagents |
1 microwave oven | Or suitable way for heating agarose and water to make gels |
1 autoclave | Or pressure cooker for sterilizing materials |
PCR machine | Thermocycler |
2 sets of pipettes | 0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 μl 1 set for primers, 1 set for DNA |
Submarine gel electrophoresis box | With forms and combs for preparing gels. |
Electrophoresis power supply | With cables for connection to gel box |
Heat block | For Eppendorf tubes |
Centrifuge | For Eppendorf tubes/strips |
Capillary electrophoresis system (genetic analyzer) | Or access to an institution that can perform this analysis |
Plastics | Disposable aerosol pipette tips, Eppendorf tubes, 8-well strips, 96-well plates, some of optical quality |
Computer with Internet connection |