Summary

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Published: June 23, 2011
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Summary

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Abstract

A capacidade de manipular a expressão genética é a pedra angular da moderna embriologia experimental dias, levando para a elucidação de múltiplas vias de desenvolvimento. Vários poderosos e bem estabelecida tecnologias transgênicas estão disponíveis para manipular os níveis de expressão gênica no mouse, permitindo a geração de ambos os perda e ganho de função-modelos. No entanto, a geração de transgênicos do mouse é tanto caro e demorado. Métodos alternativos de manipulação genética, portanto, sido amplamente procurado. In utero eletroporação é um método de entrega de genes em embriões de ratos vivem 1,2 que temos adaptado com sucesso 3,4. É em grande parte baseada no sucesso de tecnologias na eletroporação in ovo que são comumente usados ​​em pinto 5. Resumidamente, o DNA é injetado no ventrículos aberta do cérebro em desenvolvimento ea aplicação de uma corrente elétrica provoca a formação de poros transitórios na membrana celular, permitindo a absorção de DNA na célula. Em nossas mãos, os embriões podem ser eficientemente electroporated logo dia embrionário (E) 11,5, enquanto a segmentação de embriões mais jovens exigiria uma ultra-sonografia protocolo de microinjeção, como descrito anteriormente 6. Por outro lado, E15.5 é a última fase, pode facilmente electroporate, devido ao aparecimento de parietal e diferenciação osso frontal, o que dificulta microinjeção no cérebro. Em contraste, a retina é acessível através do fim da embriogênese. Embriões podem ser coletados em nenhum momento durante o período embrionário ou pós-natal precoce. Injeção de uma construção repórter facilita a identificação de células transfectadas.

Até à data, em eletroporação utero tem sido mais utilizado para a análise do desenvolvimento neocortical 1,2,3,4. Estudos mais recentes têm como alvo a retina embrionária 7,8,9 e tálamo 10,11,12. Aqui, apresentamos uma modificação no útero protocolo de eletroporação que pode ser facilmente adaptado a diferentes domínios alvo do SNC embrionárias. Nós fornecemos evidências de que usando esta técnica, podemos atingir o embrionárias telencéfalo diencéfalo e retina. Resultados representativos são apresentados, primeiro mostrando o uso desta técnica para introduzir DNA construções de expressão para os ventrículos laterais, o que nos permite monitorar a maturação de células progenitoras, diferenciação e migração no telencéfalo de embriões. Também mostramos que esta técnica pode ser usada para DNA-alvo para os territórios diencefálica em torno do 3 º ventrículo, permitindo que as rotas migratórias de diferenciar neurônios em núcleos diencefálica a ser monitorado. Finalmente, nós mostramos que o uso de micromanipuladores nos permite com precisão introduzir DNA construções em áreas-alvo de pequeno porte, incluindo o espaço sub-retiniano, permitindo-nos analisar os efeitos de manipular a expressão genética no desenvolvimento da retina.

Protocol

1. Set-up Set-up área cirúrgica, como mostrado na figura. 1A, A '. Componentes-chave do set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor, Narishige micromanipulador com porta-agulha, steromicroscope Leica, sistema de fibra ótica de iluminação, 830 ECM Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos, almofada de aquecimento e um vaporizador de anestésico isoflurano. Limpe todas as ferramentas com um líquido de limpeza ultra-sônica utilizando Bransonic Metriclean2 solução pouca e…

Discussion

Eletroporação in utero pode ser usado para analisar uma ampla variedade de processos de desenvolvimento. Por exemplo, a transfecção de genes repórter, como GFP, mCherry ou fosfatase alcalina pode ser usado para conduzir linhagem rastreamento e experiências de migração neuronal. Alternativamente, Cre recombinase pode ser transitoriamente expressa seletivamente eliminar um alelo floxed em um espacialmente e / ou temporalmente controlada maneira. Além disso, shRNA ou dominante constrói negativo pode ser …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach pelo seu trabalho inicial no estabelecimento in utero tecnologia eletroporação no laboratório CS. Este trabalho foi financiado por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) conceder (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Equipe Grant (00933-000) para CS e uma crianças de Alberta Hospital Research Foundation Grant para DMK. RD foi apoiado por uma bolsa de estudos Esperança CIHR Canadá, RC é apoiado por um Studentship FFB e LML foi apoiado por uma bolsa de formação CIHR em Genética e Desenvolvimento Infantil.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Category
Fine scissors Fine Science Tools Inc. 14078-10 Surgical Tools
Iris scissors, curved Fine Science Tools Inc. 14061-10 Surgical Tools
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Fine Science Tools Inc. 12002-12 Surgical Tools
Ring forceps, 9mm Fine Science Tools Inc. 11103-09 Surgical Tools
Eye dressing Forcep Fine Science Tools Inc. 11051-10 Surgical Tools
Dumont #7 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11271-30 Surgical Tools
Dumont #5 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11251-30 Surgical Tools
Tissue forcep-Adson Fine Science Tools Inc. 11027-12 Surgical Tools
Reflex Clip Applier World Precision Instrument 500343 Surgical Tools
Perforated Spoon, 15 mm diameter Fine Science Tools Inc. 10370-18 Surgical Tools
Autoclip Remover Mikron 427637 Surgical Tools
Silk Black Braided Suture Ethicon Inc. K871 Surgical Tools
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips World Precision Instruments 500346 Surgical Tools
ECM 830 Square Wave Electroporation System VWR-CanLab 58018-004 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P5 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P7 Instruments
Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CA62111-488 Instruments
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CAACCESS (misc.) Instruments
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH VWR CanLab CA33995-534 CPN-952-118 Instruments
Sutter P97 Micropipet Puller Sutter Instrument, Carsen Group Inc. P-97 Instruments
Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Sutter Instrument BF100-78-10 Instruments
3-Axis Coarse Manipulator Carl Zeiss Canada Inc. M-152 Instruments
Magnetic Holding Device for micromanipulator World Precision Instruments M1 Instruments
Steel Base Plate for micromanipulator World Precision Instruments 5052 Instruments
Micropipette Holder World Precision Instruments MPH3 Instruments
Micropipette Handle World Precision Instruments 5444 Instruments
Stereomicroscope Leica MZ6 Instruments
Vaporizer for isoflurane anesthetic Porter Instruments Company MODEL 100-F Instruments
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Metrex Research Corporation 10-8100 Surgical Reagents
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Sigma Aldrich G1264 Surgical Reagents
Germex for sterilizing surgical tools Vétoquinol DIN# 00141569 Surgical Reagents
BNP ophthalmic ointment Vétoquinol DIN# 00516414 Surgical Reagents
Nair® Distributed by Church & Dwight Co., Inc. commercially available Surgical Reagents
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Omega Laboratories Inc. 01938983 Surgical Reagents
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Schering-Plough 531-535 Surgical Reagents
Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218 Surgical Reagents
Lactated Ringer Solution Baxter Corporation DIN# 0061085 Surgical Reagents
Saline – 0.9% sodium chloride B-Braun Medical Inc. DIN# 01924303 Surgical Reagents
Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc. DIN# 02237518 Surgical Reagents
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Surgical Reagents

References

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Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

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