High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em
Summary
Wir beschreiben eine niedrige Kosten, hohe Durchsatz-Verfahren zum Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität in<em> E. coli.</em> Die Methode beruht auf einer einfachen visuellen Ablesung der Substratabbau, erfordert keine Enzymreinigung und ist hoch skalierbar. Dies ermöglicht das schnelle Screening von großen Bibliotheken der Enzym-Varianten.
Abstract
Cellulase-Enzyme (Endoglucanasen Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen) hydrolysieren Zellulose in Zucker-Komponente, die wiederum in Kraftstoff Alkohole 1 umgewandelt werden kann. Das Potenzial für die enzymatische Hydrolyse von Zellulose-Biomasse zu erneuerbarer Energie zu versorgen hat sich bemüht, Cellulasen für sparsamen Produktion 2 Ingenieur intensiviert. Von besonderem Interesse sind Pilzcellulasen 3-8, wobei die bereits industriell für Lebensmittel und Textilien verarbeitet wird.
Kennzeichnung der aktiven Varianten unter einer Bibliothek von mutierten Cellulasen ist entscheidend für den Engineering-Prozess, aktive Mutanten können weitere für die verbesserten Eigenschaften und / getestet werden oder eine zusätzliche Belastung von Mutagenese. Effizientes Engineering von Pilzcellulasen hat durch einen Mangel an genetischer Werkzeuge für die einheimische Organismen und durch die Schwierigkeiten bei der Expression der Enzyme in heterologen Wirten behindert. Kürzlich entwickelte Morikawa und Mitarbeiter ein Verfahren zur Expression in E. coli der katalytischen Domäne von Endoglucanasen von H. jecorina 3,9, ein wichtiges Industriezentrum Pilz mit der Fähigkeit, Cellulasen in großen Mengen ausscheiden. Functional E. coli Expression wurde auch für Cellulasen aus anderen Pilzen, einschließlich Macrophomina phaseolina 10 und Phanerochaete chrysosporium 11-12 berichtet worden.
Wir stellen eine Methode zur Hochdurchsatz-Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität in E. coli. (Abb. 1) Diese Methode verwendet das gemeinsame mikrobielle Farbstoff Kongorot (CR) auf den enzymatischen Abbau der Carboxymethylcellulose (CMC) von wachsenden Zellen auf festem Medium zu visualisieren. Der Aktivitätstest erfordert kostengünstige Reagenzien, minimale Manipulation, und gibt eindeutige Ergebnisse als Zonen des Abbaus ("Halos") in der Kolonie vor Ort. Obwohl ein quantitatives Maß für enzymatische Aktivität kann mit dieser Methode nicht ermittelt werden, haben wir festgestellt, dass Halo Größe mit insgesamt enzymatische Aktivität in der Zelle korreliert. Die weitere Charakterisierung der einzelnen positiven Klone bestimmt, relative Protein Fitness.
Traditionelle bakterielle ganze Zelle CMC / CR Aktivitätstests 13 beinhalten Gießen Agar mit CMC auf Kolonien, die Gegenstand einer Kreuzkontamination oder Inkubation Kulturen in CMC-Agar Brunnen, die weniger für großflächige Experimente ist. Hier berichten wir über ein verbessertes Protokoll, dass die bestehenden Waschverfahren 14 für Cellulase-Aktivität verändert: Zellen, die auf CMC-Agarplatten gezüchtet werden vor CR Färbung entfernt. Unser Protokoll reduziert Kreuzkontamination und ist hoch skalierbar, so dass das schnelle Screening von tausenden von Klonen. Neben H. jecorina Enzyme, haben wir zum Ausdruck gebracht und gesiebt Endoglucanase Varianten aus dem Thermoascus aurantiacus und Penicillium decumbens (siehe Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll für Enzyme, die aus einer Reihe von Organismen.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle und hohen Durchsatz Identifizierung von aktiven Enzymen, mit minimaler Manipulation. Bewegungsmelder ist ziemlich empfindlich und qualitativ spiegelt das Ausmaß der Aktivität innerhalb der Zelle. Seine einfache Bedienung macht diese Methode eignet sich für eine breite Palette von Enzym-Bibliotheken, die nur durch funktionelle Expression in E. begrenzt coli. Darüber hinaus ist Aktivitätsscreening dieser Art nicht zu Pilzcellulasen beschränk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation, und durch die UNCF / Merck Science Initiative finanziert.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, . Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
