Summary

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

Published: June 24, 2011
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Summary

Une méthode pour l'incorporation de l'ADN plasmidique dans des cellules murines rétine dans le but d'effectuer soit du gain ou de perte d'études de la fonction<em> In vivo</em> Est présenté. Cette méthode s'appuie sur l'augmentation transitoire de la perméabilité des membranes plasmiques cellulaire induite par l'application d'un champ électrique externe.

Abstract

La caractérisation fonctionnelle des gènes exprimés au cours du développement des mammifères rétine demeure un défi important. Le ciblage de gènes pour générer une perte constitutive ou conditionnelle de KOs fonction reste des coûts et de main-d'oeuvre, ainsi que beaucoup de temps. Ajoutant à ces défis, la rétine peut gènes exprimés ont un rôle essentiel en dehors de la rétine conduisant à confond involontaires lors de l'utilisation d'une approche à élimination directe. Par ailleurs, la capacité à exprimer un gène ectopique par un gain d'expérience fonction peut être extrêmement précieux lorsque l'on tente d'identifier un rôle dans la spécification du destin cellulaire et / ou la différenciation terminale.

Nous présentons une méthode pour l'incorporation rapide et efficace de plasmides ADN dans la rétine de souris néonatales par électroporation. L'application de courtes impulsions électriques au dessus d'un certains résultats intensité du champ dans une augmentation transitoire de la perméabilité de la membrane plasmatique, en facilitant le transfert de matériel à travers la membrane 1,2,3,4. Travail de pionnier a démontré que l'électroporation pourrait être utilisé comme une méthode de transfert de gène dans les cellules de mammifères en induisant la formation de pores hydrophiles membrane plasmique permettant le passage de l'ADN hautement chargé à travers la bicouche lipidique 5. Continue le développement technique a conduit à la viabilité de l'électroporation comme une méthode pour le transfert de gènes in vivo dans les tissus de souris multiples, y compris la rétine, la méthode pour ce qui est décrit aux présentes 6, 7, 8, 9, 10.

Solution d'ADN est injecté dans l'espace sous-rétinien, de sorte que l'ADN est placé entre les épithélium pigmentaire rétinien et la rétine de l'néonatale (P0) de la souris et impulsions électriques sont appliquées en utilisant une électrode de pincette. Le placement latéral de l'oeil chez la souris permet de s'orienter facilement de l'électrode de pince à l'alignement nécessaire pole pôle négatif de l'ADN-rétine positif. L'incorporation étendue et l'expression des gènes transférés peuvent être identifiés par jour postnatal 2 (P2). En raison de l'absence de migration latérale importante des cellules de la rétine, des régions et non électroporées électroporées sont générés. Non-électroporées régions peuvent servir de contrôles internes histologique, le cas échéant.

Électroporation la rétine peut être utilisé pour exprimer un gène sous un promoteur ubiquitaire, comme l'ACG, ou de perturber la fonction des gènes en utilisant des constructions ou des shRNA Cre-recombinase. Expression plus ciblée peut être atteint par la conception des constructions avec des promoteurs de gènes spécifiques de cellules. Visualisation des cellules par électroporation est réalisée en utilisant des constructions bicistronique exprimant la GFP ou par co-électroporation une expression de la GFP construire. Par ailleurs, les constructions peuvent être multiples électroporées pour l'étude des effets des gènes combinatoire ou le gain simultané et perte de fonction des gènes différents. Électroporation rétine peut également être utilisé pour l'analyse de la génomique éléments cis-régulateurs en générant des constructions d'expression approprié et mutants de délétion. De telles expériences peuvent être utilisés pour identifier les régions cis-régulatrices suffisante ou nécessaire pour l'expression des gènes cellulaires spécifiques 11. Expériences potentielles ne sont limitées que par la disponibilité de construire.

Protocol

1. Préparation de plasmide pour l'électroporation La concentration d'ADN requis pour électroporation est 5μg/μl. Cela nécessite généralement des plasmides voulu être amplifié en utilisant un Maxi-prep (Qiagen) ou une méthode équivalente suivie d'une purification et la concentration de l'ADN à la quantité de travail. Les étapes suivantes décrivent la préparation de l'ADN à la quantité de travail. Aliquot de 100 pg d'ADN (de Maxi-prep ou é…

Discussion

In vivo électroporation représente une méthode rapide et efficace pour la transformation de cellules de la rétine avec des plasmides d'expression d'ADN. Cette méthode permet à l'expérimentateur d'effectuer des études de gain de fonction en introduisant ectopique un gène d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire ou pour effectuer des études de perte de fonction en utilisant des constructions shRNA ciblant des gènes d'intérêt. Par ailleurs, plusieurs plasmid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le NIH R01EY020560-01 et par un érudit WM Keck Young en bourse de recherche médicale. Les auteurs tiennent à remercier Joseph Bedont pour son aide lors de l'imagerie de la rétine et de préparations injectables.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number Comments
Buffer Saturated Phenol Invitrogen 15513-039 N/A
Chloroform J.T. Baker 9180-03 N/A
Sodium Acetate J.T. Baker 3470-05 3 M stock
Fast Green FCF Fisher Biotech BP123-10 10 % stock
Isopropyl alcohol prep Tyco Healthcare 6918 N/A
30-guage needle Terumo Medical Corp. SG2-3013 N/A
Exmire microsyringe Ito Corporation MS*E05 N/A
Tweezertrode (tweezer electrode) BTX Instrument, Genetronics Inc. 522 N/A
Electro Square Porator (electroporator) BTX Instrument, Genetronics Inc. ECM 830 N/A
O.C.T. Compound Sakura Finetek USA 4583 N/A

References

  1. Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
  2. Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
  3. Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
  4. Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
  5. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  6. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
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  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
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  10. Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
  11. Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).

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Cite This Article
de Melo, J., Blackshaw, S. In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina. J. Vis. Exp. (52), e2847, doi:10.3791/2847 (2011).

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