在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析
Summary
许多最近的研究已经确定了在与大脑病症相关突触蛋白的基因突变。原代培养皮层神经元在研究这些疾病相关的蛋白质对树突棘的形态和运动的影响提供了极大的灵活性。
Abstract
树突棘是多数大脑内的兴奋连接的网站，并形成突触的突触后车厢。这些结构中的肌动蛋白丰富，并已被证明是高度动态的。在古典Hebbian可塑性以及neuromodulatory信号，树突棘可以改变形状和数量，这被认为是神经回路的细化和在大脑中的信息处理和存储的关键。树突棘之内，复杂的蛋白质网络连接允许树突棘的形态和数量的控制与肌动蛋白cyctoskeleton的细胞外信号。神经病理研究表明，从精神分裂症，自闭症谱系障碍的疾病状态，显示树突棘形态异常或数字。此外，最近的基因研究已经确定了在大量的基因编码突触的蛋白质突变，导致这些蛋白质可能会导致异常的脊柱可塑性的部分，这些疾病的病理生理基础的建议。为了研究这些蛋白质在控制树突棘形态/数量的潜在作用，培养皮层神经元的使用提供了几个优点。首先，这个系统可以在固定细胞树突棘的高清晰度成像以及时间推移活细胞成像。其次，在体外系统，这使得容易操纵蛋白质的功能表达的蛋白质，击倒的shRNA结构，或药物治疗。这些技术使研究人员开始解剖疾病相关的蛋白质的作用，并预测这些蛋白质的突变可能在体内的功能。
Protocol
这里所描述的协议，可以用来检查任何原代培养体系的树突棘形态和动态。 1。初级皮层神经元培养的制备准备从高密度的皮层神经元培养SD大鼠E18胚胎和胶质空调无血清培养基 1-2文化。 安乐死之一孕鼠（E18）根据ACUC程序，迅速取出子宫中的胎儿，在100毫米的Petri冰盘地方。 剖开子宫和羊膜，胎儿颈部举行（脐带完好）用一个镊子，用另一个镊?…
Discussion
上面描述的详细定量分析树突棘形态，固定或现场初级皮层神经元的线性密度和蠕动的技术重点了解突触后的机制，可能有助于到neuropathologies影响。类似的方法可以用来量化脊柱形态或运动的任何刺的神经元，包括海马锥体，浦肯野，或中等刺神经元。
这里所描述的协议，可以适应看看突触蛋白和/或药物治疗树突棘的影响的基本性质。此外，它还可以被用来评估不等骨架蛋…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢细心的编辑凯利 – 琼斯。这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予R01MH 071316阿尔茨海默氏症协会，全国的精神分裂症和抑郁症（NARSAD）研究联盟和全国自闭症研究联盟（NAAR）（星期三），美国心脏协会博士后奖学金（DPS）;美国心脏协会Predoctoral奖学金（KMW）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
Tags
Dendritic SpinesMorphologyCultured NeuronsExcitatory ConnectionsSynapsesActinHebbian PlasticityNeuromodulatory SignalsNeural CircuitsInformation ProcessingSynaptic ProteinsDisease StatesSchizophreniaAutism Spectrum DisordersAberrant Spine PlasticityPathophysiologyCultured Cortical NeuronsHigh-resolution ImagingFixed CellsTime-lapse Imaging
Cite This Article
Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).