프로토콜은 cryo – 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV – 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.
거의 30 년전의 발견 이후, 이상 6천만명는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염되었습니다 (www.usaid.gov) . 바이러스는 감염과 CD4 + T – 세포함으로써 면역 체계 타격, 그리고 면역 결핍 증후군 인수 (AIDS) 2 일으키는 파괴. HIV의 봉투 당단백질는 "스파이크"가 CD4 + T 세포의 표면에있는 CD4 수용체와 접촉을하게되면 감염이 시작됩니다. 이 상호 작용은 두 번째 세포 표면 공동 수용체 5,9와 상호 작용을 촉진 스파이크에 conformational 변화를 유도. HIV 감염 경로에 이러한 단백질 상호 작용의 의미는 근본적인 HIV 연구에 깊은 중요성을하게하고, HIV 백신의 추구 인치
더 나은 HIV 세포 연락처 및 중화의 분자 규모의 상호 작용을 이해할 필요가를 결정하는 기술의 개발 동기세포 표면 수용체 단백질 및 분자 블록 감염과 상호 작용 HIV 스파이크의 구조. cryo – 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여, 우리는 최근 ~ 20 해상도 9,14에서 기본 바이러스의 표면에 같은 구조를 결정하는 능력을 보여주었다. 이 접근은 해결 HIV 봉투 구조에 국한되지, 기타 바이러스성 막 단백질과 단백질 리포좀에 재구성하기 위해 확장될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 정화 HIV의 virions부터 시작하고, vitrified 샘플을 준비 cryo – 전자 현미경 데이터를 수집, reconstituting 및 3D 데이터 볼륨을 처리 평균 및 3D 단백질 subvolumes 분류를 통해 stepwise 진행 HIV 봉투 glycoproteins의 구조를 얻는 방법에 대해 설명하고, 단백질 모델을 생산하는 결과를 해석합니다. 우리의 접근 방식의 전산 측면 액세스하고 Biowulf GNU / 리눅스 병렬 P를 사용하여 원격으로 실행할 수 있습니다 모듈에 적응했다NIH에서 rocessing 클러스터 (http://biowulf.nih.gov) . 저가의 컴퓨터 하드웨어와 고속 네트워크 액세스와 함께이 원격 액세스, 학교 또는 가정에서 일하는 연구자와 학생들의 참여를 가능하게하고 있습니다.
cryo – 전자 현미경 입체 분류 및 평균 방법은 여기 ~ 20 해상도 봉투 당단백질의 단지 세 가지 차원 구조의 결정에 대한 허용을 제시. X – 레이의 피팅은 밀도지도에 monomeric 구성 요소의 좌표 분자 수준에서 구조 해석을 허용합니다. 오픈 소스 과학적 도구와 네트워크 인프라의 확산에 발전과 함께 저비용 컴퓨팅 장비에 계속 개선이 가능 이전에 상상할 과학 공동 노력을합니다. 우리는 이러한 발전을 활용하고 첨단 과학 기술이 다양한 연령의 학생의 도달 범위 내에 반입할 수 수 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 HIV – 1 바이러스, 스티븐 펠리니와 동료를 치료 – 2 Biowulf의 고성능 전산 기능을 사용 지원, 정화 제공을 위해, 에이즈 및 암 바이러스 프로그램, SAIC 프레더릭, Inc의의 생물학 제품과 감사 NIH, 베데스다, MD에서 리눅스 클러스터 (http://biowulf.nih.gov) 그림과 전문가 지원, 전자 현미경과 함께 지원 황비홍 회사, 그리고 이단 타일러. 이 작품은 국립 암 연구소, 국립 보건 연구소, 베데스다, MD에서 암 연구 센터에서 자금에 의해 지원되었다.
Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil | – | 200 mesh |
Protein A gold colloid | University of Utrech – The Netherlands | – | 10 nm diameter |
HIV-1 BaL | NIH, NCI, Frederick, MD | – | ~ 1011 virions/mL |
Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
Vitrobot Mark III | FEI | – | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | – | 200 keV |
Gatan Imaging Filter | Gatan | – | – |
Gatan Post-GIF CCD | Gatan | – | 2K x 2K pixels |
Gatan Cryo Workstation | Gatan | – | – |
Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | – | Oxygen and Hydrogen plasmas |
C – clips | FEI | ZIT0634 | – |
Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | – | http://biowulf.nih.gov/ |
UCSF Chimera | University of California – San Francisco | – | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
IMOD | University of Colorado – Boulder | – | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
EMAN | Baylor College of Medicine | – | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
RAPTOR | Stanford University | – | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |