Summary

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Published: June 13, 2011
doi:

Summary

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Abstract

Biz farelerin beyin infiltre lökositler (BILs) hazırlamak için bir metodu tanımlar. Biz tüm beyin hücrelerinin infiltre bir lökosit zenginleştirilmiş nüfus nasıl arındırmak için hızlı bir intrakraniyal enjeksiyon tekniği ile Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) ile enfekte fareler nasıl gösterilmektedir. Kısaca, fare, kapalı bir odasında izofluran ile anestezi ve serbest el frontal korteksin içine Hamilton şırınga ile enjekte edilir. Fare sonra bir Tenbroeck doku değirmeni ile RPMI ayıklanır ve homojenize izofluran doz aşımı ve bütün beyinleri tarafından enfeksiyondan sonra değişik zamanlarda öldürüldü. Beyin homojenatlarında miyelin ve diğer hücre enkaz kaldırmak için sürekli% 30 Percoll degrade ile santrifüj edilir. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 mikron gergin, yıkanmış ve süreksiz Ficoll-Paque Plus degrade santrifüj lökosit seçin ve arındırmak için. Lökosit sonra yıkanır ve flow sitometri ile işaretleyicidir için uygun tamponlar yeniden süspanse. Flow sitometri, enfeksiyonun erken aşamalarında C57BL / 6 farelerde doğuştan gelen bağışıklık hücreleri bir nüfusa ortaya koymaktadır. 24 saat enfeksiyonu, bağışıklık hücrelerinin birden fazla altkümelerini Gr1 +, CD11b + ve F4/80 + hücreler zenginleştirilmiş bir nüfusa sahip, BILs mevcut . Bu nedenle, bu yöntem, beyinde akut enfeksiyon bağışıklık yanıtı karakterize yararlıdır.

Protocol

1. İntrakranial virüs enjeksiyonu: Aşağıdaki teknik değiştirilmiş ve laboratuar ve meslektaşları tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Kısaca, intrakranial enjeksiyon Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) veya sahte-enfeksiyon Daniel suşu (1, 10) beyin infiltre lökositler (BILs) ortaya çıkarmak için genç farelerde (yaş tercihen 5-6 hafta) yapılır. Daniel zorlanma, fasulye zorlanma ve GDVII suşu arasında farklılık olacağını lütfen unutmayınız. BILs …

Discussion

Biz rutin beyin infiltre hücre hazırlama kalitesini belirlemek için flow sitometri ve bağışıklık hücrelerini 2, 9 farklı nüfusu ayırt etmek. Akut zaman noktalarında, BILs yöntemi CD45hi CD45lo nüfus makrofajların yanı sıra yüksek oranda nüfus içinde yüksek oranda inflamatuar monositlerin verir. Bu, beynin içinde bir tekrarlanabilir immün yanıt sağlam yöntemi ile karakterize edilebilir olduğunu gösterir.

Bu tekniği fare beyin bağışıklık hücreleri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Mayo Clinic (CLH) erken bir kariyer geliştirme ödülü, NINDS (CLH) hibe NS64571 tarafından desteklenen ve Donald ve Frances Herdrich (CLH) cömert bir hediye. Biz yardım için Mayo Clinic Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Reagent Company Catalog number Comments
TMEV Howe Lab N/A  
Daniel’s strain Invitrogen 21063-029  
isoflurane Novaplus NDC 0409-3292-49  
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0030  
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093  
Percoll GE Healthcare 17-0891-02  
10X PBS Roche 11666789001  
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02  
Trypan Blue 0.4% (w/v) Mediatech 25-900-CI  
15 ml conical tubes BD Falcon 352097  
7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder Fisher 08-414-10B  
40 μm cell strainer BD Falcon 352340  
50 mL conical BD Falcon 352070  
bovine serum albumin Sigma A9647  
sodium azide Sigma S8032  
CMF-PBS Mediatech 21-040-CV  
FACS tubes BD Falcon 352054  
fetal bovine serum Sigma F4135  
2.4G2 hybridoma ATCC HB-197  
Costar V-bottom plate Corning 3894  
Allegra X-22R centrifuge or equivalent Beckman N/A  
96-well plate bucket and rotor Beckman S2096  
Fixed-angle rotor Beckman F0360  
paraformaldehyde Sigma P6148  
BD FACS Calibur BD Biosciences N/A  
FlowJo 7.5 Tree Star, Inc. N/A  
CD45 BD Biosciences 557235 clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G) BD Biosciences 553128 clone: RB6-8C5
CD11b ebiosciences 17-0112-83 clone: M1/70
F4/80 ebiosciences 17-4801-82 clone: BM8

References

  1. Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
  2. Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
  3. Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
  4. Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
  5. Donovan, J., &amp, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
  6. Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
  7. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
  8. Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
  9. Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
  10. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).

Play Video

Cite This Article
LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747, doi:10.3791/2747 (2011).

View Video