Phage »Bioluminescent" Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A
Summary
Une méthode simple pour l'identification de pathogènes bactériens priorité est d'utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l'utilisation de phages journaliste pour la détection de<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Yersinia pestis et Bacillus anthracis sont de catégorie A des bactéries pathogènes qui sont les agents responsables de la peste et l'anthrax, respectivement 1. Bien que la présence naturelle de ces deux maladies est maintenant relativement rare, la possibilité à des groupes terroristes d'utiliser ces agents pathogènes comme une arme biologique est bien réelle. En raison de la communicabilité inhérente de la maladie, l'évolution clinique rapide, et le taux de mortalité élevé, il est essentiel qu'une flambée être détectés rapidement. Par conséquent les méthodes qui permettent la détection et le diagnostic rapides sont essentiels pour assurer la mise en œuvre immédiate de mesures de santé publique et l'activation de la gestion de crise.
Recombinante de phage journaliste peut fournir une approche rapide et spécifique pour la détection de Y. pestis et B. anthracis. Les Centers for Disease Control and Prevention utilisent actuellement les tests classiques lyse de phages pour l'identification confirmée de ces bactéries pathogènes 2-4. Ces dosages profiter des phages naturels qui sont spécifiques et lytique pour leurs hôtes bactériens. Après une croissance de nuit de la bactérie cultivée en présence du phage spécifique, la formation de plaques (lyse bactérienne) fournit une identification positive de la cible bactérienne. Bien que ces tests sont robustes, ils souffrent de trois défauts: 1) ils sont en laboratoire, 2) ils ont besoin d'isolement bactérien et la culture de l'échantillon suspect, et 3) ils prennent 24 à 36 h pour terminer. Pour répondre à ces questions, recombinante de phage "lumière taggés« journaliste ont été génétiquement modifiées en intégrant les Vibrio harveyi gènes luxAB dans le génome de Y. pestis et B. anthracis phage spécifique 5-8. Le phage résultant luxAB journaliste ont été capables de détecter leurs cibles spécifiques par rapidement (quelques minutes) et sensible conférant un phénotype bioluminescent dans des cellules receveuses. Surtout, la détection a été obtenue soit avec des cellules cultivées bénéficiaires ou avec maquette infectés échantillons cliniques 7.
Pour fins de démonstration, ici nous décrire la méthode pour la détection de phages à médiation d'un appelé Y. pestis isoler en utilisant un phage journaliste luxAB construit à partir du phage CDC peste diagnostic ΦA1122 6,7 (figure 1). Une méthode similaire, avec des modifications mineures (par exemple changement de la température de la croissance et les médias), peuvent être utilisés pour la détection de B. anthracis isole à l'aide de la B. Wβ anthracis phage journaliste:: luxAB 8. La méthode décrit la transduction de phages à médiation d'un phénotype biolumescent d'cultivées Y. pestis cellules qui sont ensuite mesurés à l'aide d'un luminomètre pour microplaques. Les principaux avantages de cette méthode sur les tests traditionnels lyse de phages est la facilité d'utilisation, les résultats rapides, et la possibilité de tester plusieurs échantillons en même temps dans un format de 96 puits de plaques de microtitration.
Figure 1. Schéma de détection. Les phages sont mélangées avec l'échantillon, les phages infecte la cellule, luxAB sont exprimés, et le bioluminesces cellule. Le traitement des échantillons n'est pas nécessaire; le phage et les cellules sont mélangés et ensuite évalués pour la lumière.
Protocol
Discussion
Cette méthode démontre la capacité du phage journaliste de détecter rapidement Y. pestis depuis le phage journaliste peut transduire un signal de réponse à la culture bioluminescents Y. cellules pestis dans les 20 minutes après l'addition de phages. Le phage journaliste est également capable de détecter directement Y. pestis dans des matrices cliniques, sans le préalable de l'isolement et la culture 7 ultérieures. Par rapport à la lyse de phages tests st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le programme Small Business Innovation Research des National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) et l'USDA Institut national de l'alimentation et l'agriculture (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
References
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