该协议提供克隆细胞系的选择和钙生物发光检测,以分析其同源GPCRs的合成节肢动物神经肽的构效关系的说明。此法可用于受体deorphanization和构效关系研究合成的模拟设计和肽/药物导致发现。
节肢动物激素受体调节许多重要的生理和行为的过程,因为他们的新农药的潜在目标。其中大部分属于G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族。我们一直专注于描绘从蜱和蚊子节肢动物激肽受体。节肢动物激肽与myotropic,利尿,和神经递质功能的多功能神经肽。在这里,为昆虫激肽的结构 – 活性关系系统的分析方法上两个异肽受体表达系统的描述。我们myotropic,利尿,和/或虱子和蚊子的消化过程可能破坏生物稳定性的激肽类似物的发展提供了重要的相关信息。
从南部的牛蜱, 小牛蜱microplus(Canestrini),和蚊子埃及伊蚊 (林奈),激肽受体稳定表达的哺乳动物细胞系CHO – K1。完成了这些受体的功能分析使用的钙的生物发光板检测措施细胞内的生物发光后肽的应用程序,这些重组细胞的细胞质中钙的含量来确定。这个方法需要的aequorin蛋白的优势,从发光水母中分离出一种photoprotein。我们aequorin质粒(mtAEQ/pcDNA1)瞬时转染稳定表达激肽受体的细胞株。这些细胞,然后用辅助因子腔肠,复合物与细胞内aequorin。这个键断裂中的钙存在,发光指示的钙离子浓度的发光水平。由于激肽受体通过细胞内钙离子的释放的信号,信号强度相关肽的药效。
此协议是一个合成几个先前所描述的的协议进行了修改,它提出通过功能板块分析(Staubly等人,2002年和马厩等 ,1997年在哺乳动物细胞系的稳定,对GPCRs的表达一步一步的指示。 )。使用这种方法,我们能够建立稳定的细胞系表达的蚊子和蜱激肽受体,比较三个蚊子激肽的药效,确定配体 – 受体相互作用的关键氨基酸位置,并执行半通量筛选肽库。由于昆虫激肽容易快速内源性肽酶降解,它们在使用中受到严重限制为控制虫害或内分泌学研究的工具。因此,我们还测试了含氨基异丁酸(AIB),以提高其效力和生物稳定性的激肽类似物。这种肽抗模拟在生物稳定昆虫激肽类似物发展的一个重要的带头作用,并可能在神经肽为基础的节肢动物控制策略的发展援助。
我们能够执行的蛛形纲(蜱,螨虫和蜘蛛),蜱激肽受体的发现的神经肽受体的功能特性,使用该协议。这种方法有三个主要的应用。第一,这项技术可应用于配基活性受体通过测量deorphanization。二,法可以解决配体 – 受体结构 – 活性关系(SAR)。三,方法可用于药物发现。此外,该协议可用于研究活动在几乎所有的GPCR受体激动剂或拮抗剂。我们开始筛选小型图书馆,以适应本议定书。我们利用该细胞系不表达无处不在的G 蛋白摹16。我们并不需要它,因为节肢动物激肽受体的信号通过Gq蛋白和细胞内钙离子级联和他们保存在哺乳动物细胞中的信号属性,如下所示。
The authors have nothing to disclose.
博士。 CJP Grimmelikhuijzen,从丹麦哥本哈根大学(丹麦)和迈克尔威廉姆森赞赏提供aequorin质粒。我们的合作者,罗纳德J博士Nachman ARS,USDA(美国德克萨斯州),是公认的肽合成和提供NOVOstar酶标仪。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
CHO-K1 cells | ATCC | CCL-61 | Manassas, VA, USA |
F12K medium | Invitrogen | 21127 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
Lipofectin Reagent | Invitrogen | 18292-011 | |
GENETICIN | Invitrogen | 10131035 | |
MC1061/P3 Ultracomp | Invitrogen | C663-03 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen Inc. | 19064 | |
FuGENE 6 Transfection reagent | Roche | 11 814 443 001 | |
96-well white thin bottom microtitere plate | Costar | 3610 | |
calcium-free DMEM media | Invitrogen | 21068 | |
Coelenterazine | Invitrogen | C-2944 | |
Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | Horsham, PA | |
NOVOstar | BMG Labtechnologies | ||
Prism software 4.0 | GraphPad Software Inc. | San Diego, CA, USA | |
T-25 and T-75 Flasks | BD Falcon | 353014 and 353135 |