细胞介导的淋巴细胞毒(CML)的检测,可用于测试自身反应性的反应,并在体外研究细胞死亡的机制。然而,利用活细胞共聚焦显微成像技术与荧光染料,类型和细胞死亡以及途径利用动力学可以更详细的研究。
1型糖尿病(T1D)是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。期间发病,患者会逐渐变得更insulinopenic胰岛素生产丢失,想必这胰腺β细胞的杀伤性T细胞的结果。 T1D发展过程的了解β细胞死亡的机制提供见解产生本病的有效的治疗方法。细胞介导的淋巴细胞毒(CML)的检测在历史上所使用的放射性核素铬51(51铬)标记的靶细胞。这些目标都暴露在效应细胞和靶细胞释放51班读淋巴细胞介导的细胞死亡的迹象。抑制剂细胞死亡减少51铬释放的结果。
作为效应细胞,激活自身反应性克隆人口的CD8 +细胞毒性T淋巴细胞(CTL)从鼠标股票转基因为AI4 T细胞受体(TCR)的α和β链隔离。 AI4激活T细胞,51铬标记的目标为16小时的NIT细胞共同培养, 释放 51铬记录来计算具体的裂解
在许多重要的生理活动,如能源生产,调节信号转导,细胞凋亡,线粒体参与。 β细胞线粒体功能的改变在T1D发展的研究是一个新的领域的研究。利用线粒体膜电位的染料甲基若丹明甲酯(TMRM)和共聚焦显微镜活细胞成像,我们监测随着时间的推移在β细胞系NIT – 1的线粒体膜电位。对于影像学检查,效应AI4 T细胞标记的荧光核染色染料Picogreen。 NIT – 1细胞和T细胞共培养,在墓室玻璃罩,并安装在一个活细胞室配备显微镜阶段,控制在37 ° C,5%的CO 2和加湿。在这些实验中的图像,每个群集为400分钟,每3分钟。
超过400分钟的过程中,我们观察到的NIT – 1细胞AI4 T细胞连接集群中的线粒体膜电位的耗散。在NIT – 1细胞共培养与MHC的同步控制实验MIS匹配的人体淋巴细胞Jurkat细胞,线粒体膜电位保持完好。这种技术可以用来观察在受到攻击的细胞毒性淋巴细胞,细胞因子或其他细胞毒性试剂的细胞线粒体膜电位的实时变化。
细胞毒性T细胞介导的β细胞的死亡是主要的病理生理 T1D 5。允许我们使用51铬释放的慢性粒细胞白血病实验研究的效靶反应 6程度。然而,T细胞介导的β细胞死亡的详细过程和途径仍然不能完全理解。由于线粒体是β细胞功能和死亡7的关键,我们专注于线粒体的变化,在视觉慢性粒细胞白血病。线粒体膜电位的耗散是一个早在导致细胞凋亡 8的线粒体功…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由来自美国国立卫生DK074656和AI56374(CEM)研究院的资助,以及青少年糖尿病研究基金会的支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
IL-2 | R & D | 485-MI | |
DMEM | Invitrogen | 11885 | |
FBS | HyClone | SH30071.03 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |