<p class="jove_content"<strong> Gerekli Malzemeler:</strong> Diseksiyon stereo mikroskop, çift taraflı bant, standart mikroskop slayt ve kapak, diseksiyon forseps (boyut 5 veya 5.5), fırça, dijital kamera ve görüntü ile silikon vakum gres, 5cc şırınga, whatman kağıt, konfokal ya da Epifloresans mikroskop yumuşak kıllı kazanım yazılım.</p><p class="jove_title"> 1. Pupa Diseksiyon</p><ol><li> 25 birkaç taze şişeleri görüntü isteyen bir stok ° C (Gal4 hattı ve UAS kontrol altında GFP etiketli füzyon proteini uygun kombinasyonu kullanarak) çapraz veya yer sinekler ayarlayın.</li><li> SOP hücreleri genellikle pupa toraks pupariation başlamasından sonra on sekiz saat hızla artmaya başlar, bu nedenle, uygun bir sinek hisse senedi veya çapraz "beyaz" pupa seçin. Beyaz pupa pupa morfoloji var, ama bir saat içinde pupariated var olduğunu belirterek, pigmentsiz pupa bir durum var.</li><li> Yaklaşık 18 saat bekleyin.</li><li> Slayt üzerine çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Pupa toplayın ve aşağı ventral yüzü, çift taraflı bant pupa halinde yapışır. Forseps operculum'un kenarına tutun (pupa durumda dorsal anterior ucu yuvarlak hatch)</li><li> Yavaşça olgunlaşmamış sineğin baş gösteren operculum'un, asansör kaldırmak ve atın.</li><li> Pupa halinde kenarındaki yırtılma başlamak için forseps kullanın. Yırtık yan pupa halinde Midsection kaldırın ve karşı tarafa getirmek, ya tamamen kaldırabilir veya bant takmak, toraks ve karın ön kısmı açığa. (<strong> Not</strong>: Gelişmekte olan sinek ve pupa halinde arasında bir boşluk vardır. Ponksiyon davanın duvar gibi sinek yırtık değil dikkatli olun.)</li><li> Arka sonuna doğru pupa halinde aynı tarafında boyunca kesim başlayın. Bir kez daha, sinek ponksiyon dikkatli olun. Sinek karşı tarafa pupa halinde çekin ve çift taraflı bant üzerine bastırın. Karın artık tamamen açık olmalıdır. Doğrudan sineğin başının altına yumuşak kıllı fırça yerleştirin. Sinek fırça ve pupa halinde ücretsiz yapışmış sonra, slayt kapalı sinek hafifçe kaldırmak için fırça kullanın.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Pupa Montaj</p><p class="jove_content"> Diseksiyonu sonra, pupa sonra slayt ve kapak arasına monte:</p><ol start="8"><li> Davadan kaldırıldı İzole pupa sonra bir bardak slayt dorsal yüzü ortasına yerleştirilebilir.</li><li> Whatman kağıt 18X18mm ortasında açılan bir 10X10 mm bırakarak bir kare kare olun. Suya daldırın kağıt doymuş kadar. Pupa etrafında yerleştirin.</li><li> Silikon vakum gres yağı ile dolu bir 5 cc şırınga kullanımı, whatman çerçeve etrafında yağ düzgün bir tabaka uygulanır. Lamel yağ tabakası içinde uygun olmalıdır (Şekil 1) ve kalınlığı, sadece biraz daha pupa çapından daha büyük olması gerekir.</li><li> 22×22 mm lamel merkezinde küçük bir damla su (1 ul) yerleştirin ve yukarıda hazırlık lamel gibi küçük su damlacığı kişileri bu durumda görüntü, notum için istediğiniz yüzey). Vakum yağ ve lamel ve pupa kütikül arasında düz bir temas yüzeyi tam bir mühür formu yavaşça sıkıştırın.</li><li> Hazırlık sonra ya epifluorecence kullanarak, dik ya da ters microcopes görüntülü olabilir, konfokal (lazer tarama veya disk tipi iplik) ya da iki-foton konfokal. Eğer dikkatli değilseniz, yetişkin sinekler birkaç gün sonra kurtarıldı.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Temsilcisi Sonuçlar:</p><p class="jove_content"> SOP özel Gal4 hattı (<em> Neuralized</em> Gal4) mitotik mili (tubulin ya da Tau-GFP) veya histon proteinleri (H2B-GFP) etiket GFP etiketli proteinlerin geçti, bir bölümü düzlemde SOP hücre bölünmesi, hücre döngüsü uzunluğu, mitoz sayısı gözlemleyebilirsiniz zaman atlamalı görüntüleme kullanarak bölümler<sup> 9</sup>. Notch sinyalizasyon düzenleme (Numb-Numb-GFP, ya da Sanpodo ortağı önemli farklı endositik bölmeleri işaretlemek için Rab-GTPases gibi hücresel organelleri hedef Diğer füzyon proteinleri (erken Rab5-GFP endosomes veya geri dönüşüm için Rab11 GFP endosomes) veya protein -GFP), asimetrik hücre bölünmesi mekanizmaları ve membran proteini ticareti önemli bilgiler verebilmesidir<sup> 2,3,7,10,11</sup>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Şekil 1: pupa diseksiyon ve montaj. A.</strong> Adım adım görüntüler pupa halinde kaldırmak ve montaj ve canlı hücre görüntüleme için sağlam pupa hazırlamak için prosedürü göstermektedir. Pupa bir cam slayt bağlı çift kaset sopa, sırt tarafında şişeden çıkarılır ve yerleştirilir. İlk sütun, operculum'un çıkarılması ve pupa davanın tarafı boyunca yırtılma. İkinci kolon, göğüs ve karın bölgesinden pupa halinde kaldırılması. Ücretsiz pupa sonra pupa halinde yumuşak kıllı fırça kaldırdı.<strong> B.</strong> Slayt ve kapak arasında pupa Montajı. Pupa cam slayt whatman kağıt nemlendirilmiş bir çerçeve ile çevrili, sırt tarafı yerleştirilir. 5cc 'lik enjektör fonksiyonları ekstrüde silikon vakum gres sürekli bir boncuk, kuruma gelen pupa korunması ve pupa toraks hafifçe aittir lamel yükselten, slayt lamel kombinasyonu mühür. Daldırma hedefleri (su veya yağ) kullanarak küçük bir damla su lamel ve göğüs kütikül arasında arayüz (1 ul), görüntü kalitesini önemli ölçüde geliştirir.<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg"> Daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Şekil 2: Temsilcisi görüntüler, canlı SOP hücreler ve pupa diseksiyonu kullanarak ve montaj prosedürü alınan farklılaşmış dış duyu organları. A</strong>. Kontrolü altında aktin-GFP füzyon proteini ifade mitotik SOP hücre bir zaman serisi çıkarılan görüntüler<em> Neuralized</em> Gal4 (<em> Neur</em> Gal4/UAS-actin-GFP), aktin kortikal birikimi bölünme karık (1 resim / her 2 dakika) dikkat edin.<strong> B</strong>. SOP kızı hücreleri Numb-Teklife Çağrı Dosyası (kırmızı) Ortağı ve Rab5-GFP ile tahrik co-ifade<em> Neuralized</em> Gal4, her iki yavru hücreye tek yavru hücre (pIIb) ve endosomes erken dağıtım Pon-RFP asimetrik dağılımı dikkat edin.<strong> C</strong>. Z-serisi volume rendering geç bir pupa aşamasında farklılaşmış dış duyu organları alınmıştır. Tırnak yapısı, bu tür mechnosensory kıllar ve epidermal kıllar manikür otofloresans (kırmızı) ortaya çıkar. Buna ek olarak, LGL-GFP (tahrik ifade MARCM sistemi kullanılmaktadır<em> Neuralized</em> Gal4) duyu organı öncü hücreler (yeşil) bir alt kümesidir. (Bu görüntüler, tüm Nikon C1 60X 1.45 NA amacı ile konfokal mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir)</p>