Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich auf<em> Staphylococcus aureus</em> Und humanen Endothelzellen.
Hier werden wir beschreiben, wie wir die Invasion von humanen Endothelzellen Studie durch bakterielle Erreger Staphylococcus aureus. Das allgemeine Protokoll kann auf das Studium der Zelle Invasion durch nahezu alle kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Die Phasen, in denen spezifische Aspekte der Invasion untersucht werden können, wie die Rolle von Aktin Umlagerung oder Caveolae, wird hervorgehoben. Wirtszellen werden in Flaschen gezüchtet und wenn Sie bereit sind für den Einsatz werden in 24-well-Platten mit Thermanox Deckgläschen ausgesät. Mit Deckgläser ermöglicht nachträgliche Entfernung der Zellen aus den Vertiefungen zu Störungen von Serumproteinen auf die Seiten der Brunnen (auf die S. aureus würde beilegen) hinterlegt reduzieren. Bakterien sind, um die erforderliche Dichte gewachsen und gewaschen, um sezernierte Proteine (zB Toxine) zu entfernen. Deckgläser mit konfluenten Schichten von Endothelzellen, neue 24-well-Platten mit frischem Kulturmedium vor der Zugabe von Bakterien übertragen. Bakterien und Zellen werden dann gemeinsam für die benötigte Zeit in 5% CO 2 bei 37 ° C. Für S. aureus ist dies in der Regel zwischen 15-90 Minuten. Thermanox Deckgläser sind aus jeder Vertiefung entnommen und in PBS gewaschen zu tauchen, um ungebundene Bakterien zu entfernen. Wenn insgesamt assoziierten Bakterien (adhärent und verinnerlicht) zu quantifizieren sind, Deckgläser dann in ein frisches gut aufgestellt, das 0,5% Triton X-100 in PBS. Sanfte Pipettieren führt zu Zell-Lyse vollständig und Bakterien werden durch serielle Verdünnung und Ausstreichen auf Agar aufgezählt. Wenn die Anzahl der Bakterien, die die Zellen eingedrungen sind notwendig ist, sind Deckgläschen in die Vertiefungen mit 500 ul Zellkulturmedium mit Gentamicin und Inkubation ergänzt weiter für 1 h, die alle externen Bakterien abzutöten hinzugefügt. Deckgläser dann gewaschen werden kann, lysierten Zellen und Bakterien durch Ausplattieren auf Agar aufgezählt, wie oben beschrieben. Wenn das Experiment erfordert eine direkte Visualisierung können Deckgläschen fixiert und für Licht-, Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie gefärbt werden oder hergerichtet für die Elektronenmikroskopie.
Der Test wir beschreiben, ist auf der Gentamicin Protection Assay, der verwendet wurde, weit, um die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien Studie. Beobachtungen von der Unfähigkeit der Gentamicin und andere Antibiotika, um die intrazelluläre Bakterien abtöten wurden in frühen Studien über die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien 8.4 genutzt. Der Einsatz von 24, 48 oder sogar 96-Well-Platten ermöglicht die Erzeugung von großen Mengen an quantitative, reproduzierbare Daten in kürzester Zeit und mit relativ geringen Kosten. Der Test ist auch attraktiv, weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert, kann zugeschnitten, um mit verschiedenen Bakterien und Zellen arbeiten, und kann verwendet werden, um die Rolle der beiden Bakterien und Wirtszelle Prozesse in Invasion 9 Untersuchung sein. In der Tat, seit der frühesten Versuche, die Gentamicin Protection Assay weithin eingesetzt, um Wirtszelle Invasion durch eine Reihe von verschiedenen Bakterien oder auch Kombinationen von Bakterien 10,11 zu messen. Während die zentralen Prinzipien sind die gleichen, viele subtile Variationen in der Methode berichtet worden. In diesem Artikel haben wir unsere Version beschrieben und angegeben, wo Änderungen notwendig sein für andere Bakterien oder Wirtszellen. Bei der Gestaltung eines Experiments zur Wirtszelle Invasion mit diesem Ansatz gibt es eine Reihe wichtiger Punkte zu beachten Maßnahme:
Bakterielle Empfindlichkeit gegenüber Gentamicin. Dies mag selbstverständlich klingen, aber es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Bakterium untersucht anfällig für Gentamicin ist bei der Konzentration, Temperatur und über die Zeitdauer verwendet werden. Im Falle von Unempfindlichkeit, kann es möglich sein, auch andere Antibiotika 5. Ein alternativer Ansatz sein kann, lytischen Enzymen (Lysostaphin, Mutanolysin, Lysozym) 12 verwenden.
Incubation und Inokulum. Bei der Durchführung dieses Tests zum ersten Mal ist es wichtig, den optimalen Inkubationszeiten und bakterielle Inokulum verwendet werden sollen, festzulegen. Daher sollten anfänglichen Experimenten untersuchen sowohl Adhäsion und Invasion im Laufe der Zeit (5 min bis zu 6 h). Es ist auch wichtig zu beurteilen, wie Invasion durch die Multiplizität der Infektion betroffen ist (MOI; Anzahl der Bakterien pro Zelle). Im Allgemeinen ist es am besten, die geringste Anzahl von Bakterien möglich verwenden, da dies Schäden an den kultivierten Zellen reduzieren. Wichtige Unterschiede zwischen den Stämmen vielleicht verpasst, wenn längere Inkubationszeiten oder großen Inokula 9,13 verwendet werden.
Zellschäden. Es ist wichtig, um Bakterien vor Waschen zu benutzen. Allerdings ist die zelluläre Schäden, die nicht Toxinproduktion beschränkt. Bakterielle Invasion, kann die Induktion von Apoptose und Störung der normalen Zellfunktionen alle verursachen Zellschäden. Dies kann das Eindringen von Gentamicin in der Zelle führen, die Tötung verinnerlicht Bakterien und den Eindruck zu erwecken, dass Invasion hat nicht 14 aufgetreten.
Inkubationsbedingungen. Die Temperatur und der Zusammensetzung des Kulturmediums können einen erheblichen Einfluss auf die Invasion. Zum Beispiel ist Invasion von HeLa Zellen, die durch Streptococcus pyogenes abhängig von der Anwesenheit von löslichen Fibronektin, die typischerweise im Serum 15. Ein weiterer Aspekt ist das Wachstum von Bakterien in das Kulturmedium im Verlauf des Experiments.
Kultur und Quantifizierung der intrazellulären Bakterien. Obwohl TX-100 kann nicht töten intrazelluläre Bakterien, kann es in ihrem Wachstum hemmen. Als solches ist es wichtig, bakterielle Replikation auf festen Medien zu überprüfen in der Gegenwart des Waschmittels. Wo betroffen sind, kann es möglich sein, niedrigere Konzentrationen des Detergens zu nutzen oder auf eine Alternative wie Saponin verwenden. Ein Vorteil des Gentamicin Protection Assay über die Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay ist, dass es weniger arbeitsintensiv ist, und es erlaubt den Nachweis und die Differenzierung von Sub-Populationen von Bakterien verinnerlicht. Zum Beispiel, S. aureus kann entweder eine normale Kolonie Typ (NCT) oder die kleine Kolonie Variante (SCV) 16, das wäre nicht unterscheidbar durch Mikroskopie von einzelnen Bakterienzellen. Ein Vorteil des Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay über die Gentamicin Protection Assay wird die Zelle Verklumpung für und dass intrazelluläre Bakterien, die ein "lebensfähiges, aber nicht kultivierbaren" Zustand erkannt wird 17 eintreten können berücksichtigt werden.
Die Untersuchung der Rolle der Wirtszelle Prozesse in bakteriellen Invasion. Viele Studien haben Inhibitoren der Wirtszelle Funktion wie Cytochalasin D, die mit Aktin Umlagerung stört beschäftigt. Solche Studien können auch Antikörper, die auf Zelloberflächenrezeptoren und siRNA Knockdown von spezifischen Genen 18. Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass diese Behandlungen keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit oder Anbau von kultivierten Zellen oder toxische Wirkungen auf Bakterien.
Zukünftige Richtungen:
NHALT "> Da dieser Test in der Regel ist in Multi-Well-Zellkultur-Platten durchgeführt wird, ist es theoretisch möglich, es zu einem High-Throughput-Screening-Betrieb, was die Prüfung von Banken potentieller Zell-Funktion Inhibitoren, Antiinfektiva und beinhalten möglicherweise anpassen Antibiotika entwickelt, um intrazelluläre Bakterien Ziel. Alternativ könnte ein solcher Ansatz verwendet, um Mutantenbibliotheken Bildschirm, um Gene in Adhäsion, Invasion oder intrazellulären Überleben beteiligt zu identifizieren. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Scherkräfte (flow) in das Modell einzubeziehen, zum Beispiel bei der Modellierung des Endothels, um mehr genau imitieren die in vivo-Umgebung. Aktuelle Fortschritte in der Entwicklung und Herstellung von Messzellen und Mikrofluidik Zellkultur-Systeme bieten die Möglichkeit des Einsatzes der Gentamicin Protection Assay in Wirt-Pathogen-Modelle, die Scherkräfte zu integrieren.Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll auf ähnliche Ansätze über viele Jahre hinweg verwendet wird. Es ist weithin für viele Arten von kultivierten Zellen und bakteriellen Spezies und kann große Datenmengen schnell und bei relativ geringen Kosten zu generieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust (WT 0795880) gefördert.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |