מבחני cytotoxicity למדוד טבעי התא הרוצח התגובות ממס ל-HIV נגועים בתאי מוגבל על ידי טוהר התאים היעד. אנו מדגימים כאן את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 נגוע T-cell תקיעות ראשונית על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4.
טבעיים (NK) תאים הרוצח הם מרכיב חיוני של התגובה החיסונית המולדת תאים הנגועים בנגיף. חשוב להבין את היכולת של התאים נ"ח להכיר lyse HIV-1 תאים נגועים כי זיהוי כל aberrancy בתפקוד התא NK נגד HIV תאים הנגועים העלול להוביל לטיפולים כי היה לשפר את פעילות cytolytic שלהם. יש צורך להשתמש ב-HIV נגועים העיקרי T-cell תקיעות כמו תאים היעד דווקא אז נגוע-T-cell שורות מבחני cytotoxicity. T-cell הקווים, גם ללא זיהום, רגישים מאוד תמוגה התא NK. יתר על כן, יש צורך להשתמש תאים ראשוניים עצמיים כדי למנוע histocompatibility העיקריים מורכבים בכיתה אני חוסר התאמה בין המטרה לבין תא מפעיל כי תגרום תמוגה. מחקרים מוקדמים הערכת התגובות תא NK cytolytic ל-HIV נגועים תאים ראשוניים לא הצליחו להראות הרג משמעותי של 1,2 התאים הנגועים. עם זאת, שימוש ב-HIV-1 נגוע העיקרי מתאי T כמו תאים היעד מבחני תא NK פונקציונלי כבר קשה בשל נוכחותם של מזהמים תאים נגוע 3. זה תא נגוע עקבי יחס תא נגוע תגרום וריאציה בהריגת התא NK בין דגימות כי לא יכול להיות בגלל השתנות בתפקוד התא NK התורם. לכן, זה יהיה מועיל לעבוד עם האוכלוסייה מטוהרים תא נגוע כדי לתקנן את מפעיל למקד יחס בין תא ניסויים 3,4. כאן אנו מדגימים את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 תאים נגועים על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4 על תאים נגועים ואת הזמינות של ערכות מסחריות כדי להסיר תאים מתים או גוססים 3-6. מטוהרים נגוע העיקרי T-cell תקיעות אז יכול לשמש מטרות degranulation או assay ציטוטוקסיות עם מטוהרים תאים NK כמו האוכלוסייה מפעיל 5-7. השימוש בתאי NK כמו effectors ב assay degranulation מעריך את יכולתו של התא NK לשחרר את התוכן ממס של lysosomes המקצועית 8 בשם "גרגרי cytolytic". עד מכתים עם נוגדן מצומדות fluorochrome נגד CD107a, חלבון קרום lysosomal הופך הביע על פני התא NK כאשר גרגרי cytolytic הפתיל הממברנה פלזמה, אנו יכולים לקבוע איזה אחוז של תאים NK degranulate בתגובה היעד הכרה התא. לחילופין, פעילות NK תא ממס ניתן להעריך assay ציטוטוקסיות המאפשר קביעת אחוז התאים היעד lysed על ידי שחרור של 51 Cr מתוך תא המטרה בנוכחות תאים NK.
כאשר נעשה בצורה נכונה מבחני המתואר בפרוטוקול זה אמור לספק תמונה מייצגת של יכולת התאים נ"ק כדי degranulate כנגד lyse HIV-1 תאים נגועים (ראה איור 5). Degranulation תא NK בתגובה ל-HIV נגועים התאים לתאי NK-HIV נגועים בתאי תמוגה צריך להיות ביחס ישר 10. תוצאות אמינות עבור שני מבחני תא NK פונקציונלי למדוד את התגובות ציטוטוקסיות ל-HIV נגועים בתאי תלויים הבידוד של מטוהרים מאוד תאים NK, כמו גם אוכלוסיה מטוהרים מאוד של תאים נגועים. לאחר מטוהרים בתאי NK ו – HIV-1 תאים נגועים הם קריטיים להשגת מפעיל מדויק למדי ליעד יחס התא. כמו כן, הסרת תאים מתים אפופטוטיים מן אוכלוסיות תאים יעד חשוב לפני תיוג Cr 51 או דגירה עם התאים מפעיל. Cr 51 עשוי להיות מופנמת על ידי התאים עוברים אפופטוזיס כמו נוכחות של תאים מתים או אפופטוטיים במהלך השלב תיוג איזוטופ תגרום לשחרור ספונטני גבוהה יהיה לעוות את תמוגה% מחושב ספציפית. יתר על כן, נוכחותם של תאים מתים או אפופטוטיים עלולה לעורר degranulation תא NK וכתוצאה מכך רמות גבוהות באופן חריג של הביטוי CD107a. Pipetting מדויק הוא הכרחי בעת הסרת תאים ללא supernatants הבאים הדגירה של תאים NK ותאי היעד של 51 מבחני Cr לשחרר, כמו הבדלים בהיקף supernatant להסיר לשכפל כל טוב תגרום סטיות תקן גבוהות. שינויים ניתן לבצע הפרוטוקולים הללו כדי להעריך את התפקיד של קולטנים ספציפיים NK מפעילה תמוגה NK של HIV לתאים תאים הנגועים על ידי דוגרים effectors או מטרות לקראת תרבות בשיתוף עם נוגדנים אנטגוניסטית לרצפטורים ספציפיים או ligands 6,11. ציטוקין שטופלו בתאי NK (למשל, IL-2, IL-15) ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקוד של תאים NK מגורה 12. כמו כן, תלוי נוגדן תא מבחני cytotoxicity ניתן לבצע בעזרת הפרוטוקולים הללו. נוגדנים נגד HIV (למשל, אנטי gp120) ניתן להוסיף את התאים היעד להכרה על ידי קולטן תא NK נמוך Fc זיקה CD16 13. מבחני אלה, למרות שהוקם כדי למדוד תגובות התא NK ציטוטוקסיות ל-HIV בתאים נגועים, יכול גם להיות שונה כדי למדוד את היכולת של התאים לייצר ציטוקינים NK הבאים הכרה HIV-נגוע התא. למרות שאנו המתואר פרוטוקול זה את השימוש בתאים במבחנה כמו תאים נגועים היעד שתיארנו לאחרונה את הדור של תאים היעד של חולים עם HIV. זה מצריך את בידודו של CD4 + T-תאים ואחריו התפשטות של התאים על פני תקופה של שבועיים בעקבות גירוי עם mitogens בנוכחות interleukin-2 11. לאחר תקופה שני בשבוע של התרחבות, הפרוטוקולים המתואר במאמר זה נעשה שימוש כדי לבודד את התאים היעד.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) | Becton Dickenson | 367874 | ||
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 15062 | ||
CMF PBS | Hyclone | SH30256.01 | ||
FBS | Hyclone | 10437-028 | ||
Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | ||
RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | ||
Penicillin / Streptomycin | Hyclone | SV30010 | ||
L-glutamine | Cellgro | 25-005-Cl | ||
T-cell Expansion Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | ||
CMF HBSS (1x) | Hyclone | SH30588.01 | ||
0.5M EDTA | 46-034-Cl | |||
NK Cell Negative Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | ||
IMDM | Gibco | 12440-046 | ||
CD4+ Positive Isolation Kit | Invitrogen | 113.31D | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | ||
Polybrene | Santa Cruz | sc-134220 | ||
CD3 PacificBlue | Becton Dickenson | 558117 | ||
CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | ||
CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | ||
CD56 APC | Biolegend | 318310 | ||
CD69 PE | Becton Dickenson | 555531 | ||
CD107a FITC | Becton Dickenson | 555800 | ||
51Chromium | Perkin Elmer | NEZ030002MC | ||
Gamma Counter Tubes | Perkin Elmer | 1270-401 | ||
2470 Automatic Gamma Counter | Perkin Elmer | 2470-0050 | ||
FACS Diva | Beckton Dickenson | 643629 | ||
FlowJo | TreeStar | FJ-9-1YR |