EpiMark 5 HMC 5 – MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 – hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β – glucosyltransferase (T4 – BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 – HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 – HMC에서 5 – MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.
DNA의 hydroxymethylation은 DNA의 긴 알려진 수정이지만, 최근 epigenetic 연구의 초점이되었다. 포유 동물 DNA는 효소 predominately CPG dinucleotides의 맥락에서, 5 MC로 사이 토신 (C) 잔류물의 5 번째 탄소 위치에 수정됩니다. 5 MC 개발과 질병에 관련된 것으로 아르 효소의 Tet 가족에 의해 5 HMC에 효소 산화 의무가 있습니다. 현재, 5 – HMC의 생물 학적 역할은 완전히 이해되지 않지만 biomarker로서의 가능성 때문에 많은 관심을 생성합니다. 이것은 마우스 배아 줄기 (ES)와의 연결을 세포에서 5 hydroxymethylcytosine을 식별하는 몇 가지 획기적인 연구로 인해 발생합니다.
bisulfite 시퀀싱 방법을 포함한 연구 기술, 쉽게 5 MC 5 – HMC를 구분할 수 없습니다. 몇 가지 프로토콜은 질량 분광법 분석이나 게놈 DNA의 소화 단일 nucleosides의 얇은 층 크로마 토그래피 액체 크로마 토그래피와 결합을 포함한 게놈의 5 hydroxymethylcytosine의 글로벌 양을 측정할 수 존재한다. 도트 얼룩 분석, immunofluorescence, 또는 hydroxymethylated DNA의 침전에 사용될 수 있지만, 이러한 항체가 하나의 기본 resolution.In 추가이없는 대상 5 hydroxymethylcytosine도 존재한다는 항체, 해상도는 immunoprecipitated DNA의 크기와에 대한 의존 microarray 실험이 프로브 디자인에 따라 달라집니다. 그것이 5 hydroxymethylcytosine은 epigenetic 규제의 게놈 또는 역할 존재 정확한 위치를 알 수 있기 때문에, 새로운 기술은 특정 로커스 hydroxymethylation을 식별할 수있는 필요합니다. EpiMark 5 HMC 5 – MC 분석 키트는 특정 loci에서 두 수정 구별을위한 솔루션을 제공합니다.
EpiMark 5 HMC 5 – MC 분석 키트 5 methylcytosine 및 특정 DNA를 로커스 내에서 5 – hydroxymethylcytosine의 식별 및 quantitation를위한 간단하고 강력한 방법입니다. 이 효소 접근 방식은 간단한 3 단계 절차에서 isoschizomers MspI과 HpaII의 차동 methylation 감도를 사용합니다.
관심 게놈 DNA는 5 hydroxymethylcytosine에 포도당 moeity를 추가 T4 – BGT와 함께 처리됩니다. 이 반응은 순서대로 독립적인, 따라서 모든 5 HMC이 glucosylated됩니다; 수정되지 않은 또는 5 – MC 포함된 DNA가 영향을받지 않습니다.
이 glucosylation는 다음 제한 endonuclease는 소화옵니다. MspI 및 HpaII 같은 순서 (CCGG)를 인식하지만 다른 methylation 상태에 민감합니다. 사이 토신 차단 절단 중 언제든지 변경 (5 – MC, 5 – HMC 또는 5 GHMC) : HpaII은 완전히 수정되지 않은 사이트를 클리브스. MspI 5 – MC 5 – HMC 아니지만 5 GHMC를 인식하고 클리브스.
프로토콜의 세 번째 부분은 PCR에 의한 로커스의 심문이다. 입력 DNA의 조금은 20 NG를 사용할 수 있습니다. 실험 (glucosylated와 소화) 및 제어 (모의은 glucosylated와 소화) 관심 CCGG 사이트 (100-200 BP)를 측면 primers와 대상의 DNA 증폭이 수행됩니다. CPG 사이트 5 hydroxymethylcytosine 포함되어있는 경우 밴드가 glucosylation과 소화 후에 감지 아니지만 비 glucosylated 제어 반응 인치입니다 실시간 PCR은 hydroxymethylcytosine이 특정 사이트에 얼마나의 근사치를 제공합니다.
본 실험에서는, 우리는 엔드 포인트 PCR에 의한 마우스 Babl / C 뇌 샘플에서 5 hydroxymethylcytosine 금액을 분석합니다.
본 실험을 설정할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 첫째, 게놈 DNA의 glucosylation 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. T4 – BGT의 시퀀스 특이성이 알려져 있으며 그것은 기판 시퀀스에 대한 선택의 여지가 없어 보인다되지 않습니다. 따라서, 어떤 경우에, 더 이상 부화 시간이 필요할 수 있습니다. 둘째, MspI 및 HpaII 소화 배경 신호를 방지하기 위해 완료해야합니다. 이러한 제한 효소의 경우, 우리는 4 시간 배양 시간을 권장하지만, 불완전 절단이 관찰되면 더 이상 incubations을 수행할 수 있습니다. 셋째, 입력 DNA 금액은 DNA의 20 ngs는 엔드 포인트 PCR에 사용할 수 있기 때문에, 상황에 따라 조정할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 5 – MC 5 – HMC의 부량에 대한 게놈 DNA와 병렬로 실행할 수 있습니다 공급 제어 DNA의 사용을 권장합니다.
The authors have nothing to disclose.
Sriharsa Pradhan, 섀넌 모리 키니, 잠시 만요 경인 친, Jurate Bitinaite, 유 청, 피에르 올리비에 Esteve, Romualdas Vaisvila, 스티븐 E. 야콥센의 연구소, UCLA. 이 작품은 부분적으로 NIH 1R44GM095209 – 01에 의해 지원되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
molecular biology grade water |