我们展示,如何使用双光子显微镜观察中性粒细胞在受感染的肺部的粒细胞动力学,而他们吞噬病原体或产生中性粒细胞(以英语为母语的英语教师)外的陷阱。
经过胃肠道,肺,是世界第二大脊椎动物的身体和环境之间的相互作用的表面。在这里,一个有效的气体交换,必须保持下去,而同时避免了在正常呼吸时吸入的多种病原体的感染。为了实现这一目标,存在一个高超的体液免疫和细胞免疫机制相结合的防御战略。急性肺防御的最有效措施之一是招聘的中性粒细胞,,吞噬吸入病原体或杀死他们释放细胞毒性化学物质。最近除了中性粒细胞库是其爆炸释放外,细菌或真菌甚至NET释放细胞死亡后,可以被捕获或灭活的DNA,以英语为母语的英语教师。我们在座的方法,允许一个直接观察到嗜中性粒细胞,在最近肺部感染迁移,吞噬病原真菌以及可视化整个受感染的组织,他们已经产生广泛的以英语为母语的英语教师。该方法描述了7小时后,小鼠气管内感染与模具曲霉和其考试分生孢子多色时间推移双光子显微镜厚可行的肺片的准备。这种方法允许一个直接调查本地肺组织中的抗真菌防御肺免疫力的详细调查,从而打开了新的途径。
实时双光子显微镜在体内或在完整的器官已经获得了在处理与免疫细胞的生理机能的研究在过去10年的深刻重要性。正是有了这种技术,首次成为重要事件,如淋巴结内的T细胞激活的动态可见2-4。最近,研究人员也开始分析特定的细胞功能的效应细胞在淋巴组织中使用此方法5代的第一个步骤一样。
然而,尽管一些新的生物概念使用此方法已被揭露出来,也有仍然充满挑战,没有活体可视化研究迄今已发表的重要问题。值得注意的是,这适用于哺乳动物的肺。本机关的有趣的方面,各种空气中的病原体进入端口,使得它在免疫过程在哺乳动物体内发生的最关键的表面之一。每一个在整个寿命的气息,不必要的颗粒被吸入其中一些有可能诱发危及生命的感染 6 。这是不言自明的,在这样一个敏感的和濒危的网站的一个严密的防御机制,网络,需要将目前参展的免疫反应的整个剧目。另一方面,这是非常重要的,严格控制对在这样一个“脏”的地方潜在的病原体诱导免疫斗争。夸张的免疫系统反应的大规模刺激非特异性免疫细胞的动作7,8时受伤的器官组织损害自己的身体承受的高风险。
在这些想法,那将是非常有趣和有用的,有可能在体内条件下,调查真正的细胞的行为,在哺乳动物的肺。然而,事实上,这种制度至今没有得到成功实施清楚地指出已成立了一个工作协议要解决的巨大的困难。最苛刻的挑战可能是集中稳定。肺负责呼吸的器官是在所有三个方向的空间,实现吸入下不断运动。仅这一情况会导致严重的成像问题,也算是一个活体成像仪“噩梦”。维空间中的任意轻微的议案,已经有一个微观的观点,这需要与稳定,以产生有意义的图像 9微米精度的大规模恶化的效果。由于其固有的紧张的地方重点 ,10,双光子显微镜更是敏感的焦点不稳定,只是在Z方向的几微米的范围内,在一定的结构错位是相当于一个重点完全丧失,从而一个失败的实验。
在这项研究中观察免疫细胞在小鼠肺癌的协议仍然没有在体内的应用,而是一个近似在一个功能完整的肺11的情况。成像淋巴细胞的体外方法,例如在explanted淋巴结节点,已被证明产生的结果为true,相当于在体内观察12,因此是高度相关的5。 在肺片,这是我们的做法可能实地观测,在切除后不久,肺部感染的地方。在切割过程中的3D完整的琼脂糖基质,一个必不可少的步骤,以便精确控制切割过程中,肺的保证。虽然是必要的冷却explanted肺短的时间内,让一个凝固的琼脂糖基质,它有可能返回到接近生理条件下,切割和组织复温后的细胞。这清楚地表明我们的数据,这表明,在这些条件下的中性粒细胞非常活跃,并展示其敏捷的吞噬细胞,这是曲霉感染的有效清除所需的全部潜力。他们巡逻的肺组织,通过上皮屏障,以达到肺泡内部分传递,此外,他们积极参与了真菌孢子11。这项工作的一个重要发现是外观类似曲霉菌感染的器官的中性粒细胞(以英语为母语的英语教师)外的陷阱结构。以英语为母语的英语教师是最近发现了一个新的防御机制在中性粒细胞 13 。然而,自2004年最初的描述,已在动物模型或已观察到这一现象或缺乏人类的生理或病理条件下的数量爆炸式增加14-16。有趣的是,这些结构上花了这么多不同的群体,虽然这么多的工作已,大多数报告仍然非常描述的水平上,并没有多少了解净释放及其调控机制。随着我们的协议中,我们能够在第一时间出现在肺部感染的净纤维。此外,我们可以证明,刚刚招募的中性粒细胞以及分子真菌结构,其发生或抑制11重要性。这清楚地表明我们的方法的潜力进行调查NET形成更详细的单步。人们可以认为例如使用合适的基因敲除小鼠的中性粒细胞,观察其继转移实验净形成的能力。
因此,虽然从外周血中性粒细胞移民的直接观察是不是由于这个系统后器官explantation的血液供应不足的可能,我们仍然相信,我们的协议是一个有价值的,也比较容易处理的方法,使成像在对肺部感染的免疫防御的早期或晚期的步骤。因此,这是一个对调查范围内的活体动物的肺呼吸这种现象的重要一步。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢帮助优化仔细阅读了手稿的活体电影,乔纳森博士林德基斯特拉尔斯Philipsen博士,并在方法的发展进行有益的探讨和意见Gunzer实验室的所有成员。这项工作是由补助金爵从德意志研究联合会(DFG SFB 854)