Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi
Summary
Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.
Abstract
Apikal etki 'ücretsiz' yüzeyleri yüzleri ve bazolateral membran substrat ve komşu hücrelerle temas biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı apikal ve bazolateral etki alanı içine plazma zarı kutuplaştırırlar epitel hücreleri. Her iki membran etki, bir difüzyon bariyeri oluşturan sıkı bağlantıları ayrılır. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri, epitel hücreleri polikarbonat filtreler yüksek yoğunluklu numaralı seribaşı ve birkaç gün 1 2 kültüre Apikal-bazolateral kutuplaşma kültürü başarıyla değinmeyecek. Ras süperailesinin RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ve Rab13 3 4 5 6 7 gibi küçük GTPases bir dizi hücre polarite kurulması ve bakımı tarafından düzenlenir. GDP-bağlı etkin olmayan bir devlet ve aktif bir GTP bağlı devlet arasındaki tüm GTPases gibi bu proteinlerin döngüsü. Bu bisiklet 8 ile nükleotid bağlayıcı bölgelerinde spesifik mutasyonların etkileyebilir. Örneğin, Rab13T22N kalıcı GSYİH-form kilitlenir ve böylece 'olumsuz baskın' olarak adlandırılan, Rab13Q67L artık GTP hidroliz ise ve bu nedenle bir 'baskın aktif' devlet 7 kilitlenmiş durumda . Hücreleri, kendi işlevlerini analiz etmek GTPases iki baskın baskın negatif ve aktif allel genellikle endojen proteinlerin 9 fonksiyonu ile müdahale yüksek seviyelerde ifade edilir. Kısa bir miktarı aşırı ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak için zarif bir şekilde, filtre, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak destekler yetişen polarize hücrelerinin çekirdekleri doğrudan ilgili proteinleri kodlayan plazmid tanıtmaktır. Bu çoğu zaman özellikle apikal veya bazolateral etki alanı sıralanır plazma membran reseptörleri kodlayan plazmid muhabiri ko-enjeksiyon ile birleştirilmiştir. Bazolateral etki sıralama kargo analiz etmek için sık sık kullanılan bir kargo veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSVGts045) 10 ısıya duyarlı bir allel . Bu protein, 39 ° C'de düzgün bir şekilde katlayın ve ilgi düzenleyici protein sitoplazmada monte edilir ve böylece endoplazmik retikulum (ER) muhafaza edilecektir. Bir kayma ile 31 ° C VSVGts045 plazma zarı 11 ER ve seyahat düzgün kat terk etmeye izin verecek. Bu kovalamaca genellikle temiz sonuçları neden daha fazla protein sentezini önlemek için Siklohekzimidsiz varlığı yapılır. Burada detaylı olarak, kapsamlı bir analiz bazolateral sıralama yer alan düzenleyici proteinlerin izin sıcaklık vardiya de dahil olmak üzere polarize hücreler ve sonraki inkubasyon plazmid microinjecting prosedürü açıklar.
Protocol
Discussion
, Başarılı bir mikroenjeksiyon deney için en kritik adımlar hücrelerinin DNA ve polarite kalite ve saflık. Polarize hücreler olmadan, enjeksiyon kontrolü zaten VSVG mistargeted olacak ve deney kullanılamaz. DNA kalitesiz ise, DNA yoksullara açan bir iğne ya da istenilen protein hiçbir ifade tıkayabilir. Ayrıca, böyle pRKV gibi yüksek ekspresyon düzeyleri yol açtığı bilinen ifade plazmid kullanmak için tavsiye edilir.
Diğer kargo proteinler sıralamak için test etmek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık (GM070736) National Institutes of H. Fölsch bir hibe ile finanse edildi. SF Ang A * STAR Lisansüstü bursu tarafından desteklenen ve RS Kang Hücresel ve Moleküler Temelleri (GM8061) Hastalığı Eğitim Programı tarafından desteklenen
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
