Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.
Abstract
Kennis van het precieze aantal levensvatbare cellen in een bepaald volume van een celsuspensie is vereist voor veel routine weefselkweek manipulaties, zoals plating cellen voor immunocytochemie of voor de cel transfecties. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle methode om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren van de cel concentratie en het totale aantal cellen met behulp van een hemacytometer. Deze procedure vereist in de eerste losmaken cellen van een groei oppervlak en resuspenderen ze in de media. Vervolgens worden de cellen verdund in een oplossing van trypan blauw (ideaal om een concentratie die geeft 20 tot 50 cellen per kwadrant) en geplaatst in de hemacytometer. Ten slotte is het gemiddelde van de tellingen van levensvatbare cellen in een aantal willekeurig geselecteerde kwadranten, de verdeling van de gemiddelde door het volume van een 1 mm 2 kwadrant (0,1 pi) en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor geeft het aantal cellen per liter Vermenigvuldigen deze cel de concentratie van het totale volume in ui geeft het totaal aantal cellen. Dit protocol beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), maar kan ook gebruikt worden voor vele andere celtypes.
Protocol
Passage menselijke neurale stamcellen Let op: Raadpleeg de passage menselijke neurale stamcellen artikel over hoe je los te maken en resuspendeer de cellen. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 De voorbereiding van de celsuspensie voor tellen Plaats 25 pi van 0,4% trypan Blue oplossing en 20 pl van de cel media in een eppendorfb…
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle manier is om de cel concentratie te bepalen voor een verscheidenheid van experimenten met cellen. Met behulp van de snelkoppeling beschreven in 3d, kan men snel en nauwkeurig bepalen van de cel concentratie en het totale aantal cellen in een bepaald volume.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children's Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Phase Contrast Hemacytometer
Tool
Hausser
02-671-54
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4%
Reagent
Gibco
15250-061
Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #