وصفت وسيلة فعالة للحصول على تخصيبه بدرجة الكسور الانتصافي قابلة للحياة من خصية الفأر ، الذي يجمع بين المكرر الخلية تفارق بروتوكول مع الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS). هذا الأسلوب تستفيد من الاختلافات في المحتوى وكثافة النووية DNA الكسور الانتصافي منفصلة.
Abstract
كانت الطبيعة غير المتجانسة من أنواع الخلايا في الخصية وعدم وجود نماذج الانتصافي خلية ثقافة عقبات كبيرة لدراسة البرامج التمايز الفريدة التي تظهر خلال الانقسام الاختزالي. وقد وضعت اثنين من الطرق الرئيسية لتنقية ، بدرجات متفاوتة ، وكسور مختلفة من كلا الانتصافي الكبار والحيوانات غير ناضجة : تصويل أو Staput (الترسيب) باستخدام جيش صرب البوسنة و / أو تدرجات percoll. كل من هذه الأساليب تعتمد على حجم الخلية وكثافة لفصل الخلايا الانتصافي 1-5. عموما ، باستثناء عدد قليل من السكان الخلية 6 ، هذه البروتوكولات لا تسفر نقاء كافية للسكان الخلية الانتصافي العديدة والتي هي ضرورية لإجراء تحليلات مفصلة الجزيئية. وعلاوة على ذلك ، يمكن مع مثل هذه الأساليب يمكن تنقيته عادة نوع واحد من الخلايا الانتصافي في وقت معين ، والذي يضيف مستوى إضافي من التعقيد فيما يتعلق استنساخ والتجانس عند مقارنة عينات الخلايا الانتصافي.
هنا ، نحن تصف طريقة المكرر الذي يسمح للمرء أن يتخيل بسهولة ، وتحديد ، وتنقية الخلايا الانتصافي من الخلايا الجرثومية الى أرومة النطفة في الجولة ، وذلك باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية جنبا إلى جنب مع تلوين 33342 هويشت 7،8. هذا الأسلوب يوفر لقطة الكلي للعملية برمتها الانتصافي ويسمح احد لتنقية عالية خلايا قابلة للحياة من معظم مرحلة الانقسام الاختزالي. ويمكن بعد ذلك تنقية هذه الخلايا يتم تحليلها بالتفصيل عن التغييرات التي تصاحب التقدم الجزيئية من خلال الانقسام الاختزالي ، على سبيل المثال التغيرات في التعبير الجيني 9،10 وديناميات الإشغال في المناطق الساخنة من النيوكليوسومات تأشب الانتصافي 11.
Protocol
ويمكن فصل هذا البروتوكول في خطوتين رئيسيتين : (1) التفكك وهويشت 33342 من خلايا الخصية تلطيخ الماوس تليها ، إذا لزم الأمر ، (2) FACS الفرز من الكسور في الانتصافي ذات الصلة ، بما في ذلك جميع مراحل الانقسام الاختزالي ، من الخلايا الجرثومية الى جولة أرومة النطفة. جمعها مرة واحدة ?…
Discussion
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يسمح احد لتنقية واحد من الفئران الذكور البالغين مجموعة كاملة من الخلايا مرحلة الانتصافي مع درجة نقاوة عالية جدا ، مما يسمح للمحققين لدراسة ديناميات هذه العملية الأساسية. ويمكن استخدام الخلايا النقية للعديد من التطبيقات بدءا من است…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع في جزء من الأموال من ولاية فلوريدا لسكريبس وأرقام وR21HD061304 R01GM085079 جائزة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، على التوالي. هذا هو الرقم 20917 مخطوطة من معهد سكريبس للأبحاث.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Collagenase Type-1
Worthington
CLSS1
Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C
Trypsin
Worthington
TRL3
Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C
Hoechst 33342
Arcos
230001000
Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C
DNAse I
Sigma-Aldrich
DNEP
Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C