Summary

から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</sup p53の - / -</supマウス

Published: April 03, 2011
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Summary

このビデオでは、マウス胸腺リンパ腫細胞株を確立するためのプロトコルを示す。およびp53 – / – – 胸腺リンパ腫を有するマウスはこのプロトコルに従うことによって、我々は成功したいくつかのATM – /からT -細胞株を確立している。

Abstract

確立された細胞株は、研究に実験動物の使用を減らすことができる重要な研究ツールです。特定のATMのような遺伝子改変マウスの系統、 – / – および p53 – / -は一貫して、人生の早い段階1,2の胸 ​​腺リンパ腫を開発し、その結果、マウスのT細胞株の導出のための信頼できるソースとして利用することができます。ここでは、前述のプロトコール1,3で説明されているインターロイキンを追加することなく、確立されたマウス胸腺リンパ腫のT細胞株の開発のための詳細なプロトコールを提示する。腫瘍が3〜6カ月歳のマウスから採取した、猫背の姿勢の観察に基づいて、目に見える腫瘍の最も初期に通知されたときに、貧しいグルーミングおよび感受性株の1,4の浪費、呼吸をこじつけ。 / – – [FVB/N- tm1Led / J] 2 p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5匹のマウス我々は正常にこのプロトコルを使用していくつかのT -細胞株および ATMの近交系を確立している。我々はさらに確立されたT細胞集団の90%以上がCD3、CD4とCD8を発現していることを示しています。安定的に確立された細胞株と一致し、現在のプロトコルを使用して生成されるT細胞は、一年以上継代されています。

Protocol

1。腫瘍の解剖腫瘍切開の場合は、きれいなペーパータオルや使い捨て外科用ドレープは、解剖のパッド上に配置され、70%エタノールを噴霧。 このプロトコルのためのマウスは、定期的にCO 2で安楽死されています。解剖パッドで安楽死させたマウスを重ね、エタノールで動物の両面をスプレー。マウスは足を通して挿入し、70%エタノールで十分に噴霧し、4つ以上の?…

Discussion

このプロトコルでは、我々は二つの異なるマウスの遺伝子型からマウスT細胞株を樹立するための詳細な手順を提供し、 – / – [FVB/N- tm1Led / J] p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 。 / – –三(5回の試行のうち)p53の– / –このプロトコルは、6の合計(7回のうち)ATMを使って、マウスのT細胞株は、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、有用な議論をコロンビア大学で微生物学免疫学教室から博士ボリスReizisに感謝したい。我々はまた、フローサイトメトリーおよびビデオ編集の支援のための陸黄との技術援助のために獣医学部の大学、コーネル大学で微生物学免疫学専攻から博士マーガレットバイノー、博士ロッドマンゲッチェルとDeequa Mahamedに感謝したい。 – / –マウス著者らはまた、p53を繁殖し、遺伝子型決定のためにワイス研究所からその重要な原稿や映像制作の見直し、そしてステファニーYazinskiためデュアメルとワイスの研究室のメンバーに感謝したい。動物実験は、コーネル大学動物実験用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。この研究は米国農務省、協同組合の国家研究、教育、および拡張サービス、動物の健康と疾病の研究プログラム(GEDおよびRSWに)とNIHの助成金R03 HD058220とR01CA108773(RSWまで)で提供される資金によって部分的にサポートされていました。ビデオはデュアメル&ヴァイス研究所から担当者が社内の設備を用いて作製した。

Materials

  • Ice bucket
  • 70% ethanol
  • Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
  • Two sets of small sterile scissors and forceps
  • Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
  • Sterile 18 gauge needles
  • 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
  • 10% buffered formalin
  • Tissue culture flasks
    • T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
    • T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
  • 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
  • Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
  • Culture medium
    • RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
      • 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
      • 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
      • 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
      • 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
  • Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
  • Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
    • anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
    • anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
    • anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
  • Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
  • Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
  • 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)

References

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  2. Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
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  8. Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).

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Cite This Article
Jinadasa, R., Balmus, G., Gerwitz, L., Roden, J., Weiss, R., Duhamel, G. Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice. J. Vis. Exp. (50), e2598, doi:10.3791/2598 (2011).

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