Применимость анализа клоногенных для оценки репродуктивной жизнеспособности была создана более 50 лет. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с прилипшие клетки.
Клоногенных (или колониеобразующих) анализа была создана более 50 лет; оригинальная статья, описывающая метод был опубликован в 1956 году 1. Помимо документального метода, первоначальное исследование ориентиром создается при первом радиационно-дозовой кривой для рентгеновских облученных млекопитающих (HeLa) клеток в культуре 1. В принципе, анализ клоногенных позволяет оценить различия в репродуктивных жизнеспособность (способность клеток к воспроизведению потомства, то есть одну ячейку, чтобы сформировать колонию 50 и более клеток) между контролем необработанных клетках и клетках, которые подверглись различные методы лечения, такие как воздействие ионизирующего излучения, различные химические соединения (например, цитостатики), либо в других случаях генетических манипуляций. Анализа стал наиболее широко принятый метод в области радиационной биологии и широко используется для оценки радиационной чувствительности различных клеточных линий. Кроме того, анализ клоногенных обычно используется для мониторинга эффективности излучения изменения соединений и для определения эффектов цитотоксических агентов и других противораковых терапии на колониеобразующих способности, в различных клеточных линий. Типичный выживания клоногенных эксперимент с использованием сторонником линии клетки включает в себя три отдельных компонента, 1) лечение клеточный монослой в колбах культуре тканей, 2) подготовка одного суспензии клеток и покрытие соответствующее число клеток в чашках Петри и 3) установление и окрашивание колонии Следующие соответствующего периода инкубации, которые могут варьироваться от 1-3 недель, в зависимости от клеточной линии. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с приверженцем клеточные линии с использованием увековечены кератиноцитов человека клеточной линии (FEP-1811) 2. Кроме того, наши цели, чтобы описать общие черты анализов клоногенных в том числе расчет эффективности покрытий и выживания фракций после контакта клеток к радиации, и примером модификации радиационно-ответ с использованием природных формулировка антиоксидант.
В этом примере человека FEP-1811 кератиноцитов лечили различные концентрации до 100 мкг / мл СПЛ; данные будут показаны на 20 мкг / мл СПЛ в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После лечения клетки облучали 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 ?…
The authors have nothing to disclose.
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). HR поддерживается австралийской аспирантуре и BakerIDI ярких наград искры. Эта работа финансируется за счет CRC для биомедицинской визуализации Development Ltd (CRC-BID), созданы и поддерживаются в совместную программу исследований австралийского правительства центров. СО является получателем австралийской аспирантов награду и CRC-BID дополнительные стипендии.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |