Summary

人外周血NK细胞的扩展,纯化和功能评估

Published: February 02, 2011
doi:

Summary

在这里,我们描述了一种方法,有效地扩大和净化人类NK细胞的大量和评估它们的功能。

Abstract

自然杀伤(NK)细胞,发挥对各种传染病的微生物和肿瘤免疫监视的重要作用。 NK细胞在体外的能力,扩大有限已成为制约NK细胞免疫治疗的发展。在这里,我们描述了一个方法,有效地扩大功能NK细胞体外大量使用K562细胞表达膜结合IL21,作为人工抗原提呈细胞(AAPC )。

NK细胞收养疗法利用细胞耗尽的T细胞或NK细胞的阳性选择捐助的稳态leukapheresis获得的产品。该产品通常是在IL – 2激活过夜,然后管理翌日1。由于低频外周血NK细胞,NK细胞的数量相对较少,已交付的临床试验。

不能传播NK细胞在体外已为最佳的临床结果产生足够的细胞数量的限制因素。一些NK细胞的扩张(超过1-2周的5-10倍)通过高剂量IL – 2仅2。激活自体T细胞可以介导NK细胞扩张,想必也通过局部细胞因子3的释放。与间质的基质或人工抗原提呈细胞(AAPCS)的支持,可以支持扩展的NK细胞从外周血和脐带血 4 。结合NKp46和CD2抗体包被的磁珠激活NK细胞扩张(美天旎生物技术公司,奥本CA)是目前市场上销售,造成约100倍,在21天的扩张。

使用AAPC扩大或激活NK细胞的临床试验正在进行中,一个白血病细胞株CTV – 1素和激活NK细胞无显着扩大。一,二审利用NK细胞扩展的EB病毒拼箱,实现了平均490倍,扩大在21天6。第三,利用基于一个K562 AAPC转4 – 1BBL(CD137L)和膜结合IL – 15(MIL – 15)7,取得了在21天的平均NK扩张277倍。虽然,NK细胞扩大使用K562 – 41BBL – mIL15 AAPC高度细胞毒性, 在体外体内未展开的NK细胞相比,参与的ADCC,其增殖是有限的,归结到端粒缩短8由衰老。最近的NK细胞的350倍扩大使用K562细胞表达MICA,4 – 1BBL和IL15 9的报道。

我们的NK细胞扩展的方法描述,此处产生的NK细胞不衰老的迅速扩散,实现在21天的中位数为21,000倍扩张。

Protocol

1。从Buffy大衣的外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞(PBMC)的聚蔗糖 – 帕确来自健康捐赠者巴菲外套leukapheresis派生样本的浮力密度离心获得。 聚蔗糖帕确离心作为生产商的协议稍作修改。 PBS将正常的捐助者的血液银行捉鬼外套到终体积为140毫升(典型的棕黄色大衣量为40-70毫升)。 层35毫升15毫升(4管)聚蔗糖 – 帕确捉鬼外套样品。 在400克离心20分钟不带刹车。 恢复从聚蔗糖 – 帕确外周血:等离子接口,不放弃的聚蔗糖 – 帕确底部的红细胞。 洗净外周血单个核细胞用PBS洗3次,每次10分钟,离心于400克。 在这个阶段的NK细胞膨胀或NK细胞,外周血单个核细胞可以直接使用可以通过RosetteSep隔离(第4) 剩余的外周血单核细胞可以被冻结在FBS的液态氮中含10%DMSO。 吸聚蔗糖和收集到两个50 mL离心管中,从第5步中的红细胞,用PBS(添加50毫升大关)洗三次,每次吸出上清液略读红细胞层的顶部删除粒。 RosetteSepNK细胞的纯化(参见第4节)的红细胞,可立即使用,或存储在同等体积的Alsever的解决方案,在4 ° C,为以后使用的红细胞(可存储最多为4周)。 2。 NK细胞扩张使用外周血或纯化的NK细胞,NK细胞可以启动扩大。在结束了一个为期三周的扩张所需的NK细胞数量的基础上,量的扩张外周血可以是多种多样的,代表结果的详细信息部分。 (见注1) 刺激1 0天对于每个5X10 6外周血扩大,数量和使用在100 Gy的伽玛辐照, 照射 10X10 6 K562 CL9 mIL21。 照射后,用PBS重悬在NK细胞扩张媒体(NKEM)洗细胞。 种子5X10 6外周血10X10 6照射K562 CL9 mIL21(1:2比例)在40毫升的NKEM在T75烧瓶中,并放置在一个孵化器直立在37 ° C和5%的CO 2 。 3和第5天恢复细胞在400克离心5分钟,并更换新鲜NKEM媒体的一半(整个媒体音量加入新鲜的IL – 2),并继续文化。 刺激2 第7天计数细胞的数量,在文化,在一个星期结束。 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞(见注2) 对于每个5X10 6 restimulated细胞,数量和使用伽玛辐照在100 Gy的照射5X10 6 K562 CL9 mIL21 。 在总额2.5 × 10 5细胞/ mL添加照射K562 CL9 mIL21(1:1比例),重悬在NKEM人数相等(见注3)。 种子细胞在T75烧瓶(最高,每50毫升容量瓶中)。 10和12天计数的细胞数量。 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的整个媒体(见注3)。 第14天在两个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞(见注2) 如果扩张开始从外周血NK细胞可以在这个阶段使用扩展RosetteSep净化协议(参考第四节)纯化。如果扩张开始从纯化的NK细胞进行刺激3。 净化后预留5 × 10 5细胞表型流式细胞仪验证的NK细胞(如在第8步)的纯度。 继续刺激使用纯化的NK细胞(见注4)3。 刺激3 NK细胞悬浮照射K562 CL9 mIL21 NKEM根据手机号码(1:1比例)(见注3)。 17和19天计数的细胞数量。 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的媒体(见注3)。 第21天在三个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。 恢复1 × 10 6流式细胞仪分析细胞完整的NK细胞表型抗体面板(见表1) 。 冻结在FBS的细胞用含10%DMSO在5X10 7%,以供将来使用的小瓶细胞的最大密度。 3。 NK细胞毒性试验在NKEM解冻小瓶NK细胞和种子,前一天到PErforming细胞毒试验,以便恢复。 对于每个NK细胞的细胞毒作用,使用单一的目标细胞株,6×10 5 NK细胞和 3X10 5靶细胞检测的要求(见注5)。 准备稀释钙黄绿素- AM NKEM(股票1 mg / ml的DMSO)(见注6)的CAM媒体。 重悬在1毫升CAM媒体10 6靶细胞(见注7)。 在37 ° C孵育1小时,偶尔晃动。 悬浮NK细胞在1 × 10 6细胞/ ml的细胞和NK细胞悬液200uL,每个U型底部的3口井的96孔板对应到10:1 E:T比例如图1所示。 (见注8) 新增完整的媒体100uL除了“最大”的所有其余井。 加入100uL 2%TRITON X – 100“最大”。 执行串行稀释度为5后续电子邮件的NK细胞,T细胞转移100uL每次比例,拌匀。丢弃从上井(E:T比值为0.3125:1)100uL。 钙黄绿素装载1小时后,在NKEM洗两次靶细胞,5分钟1200转离心。 (见注9) 重新点票的靶细胞和悬浮在1 × 10 5细胞/ mL。 每孔加入100μL靶细胞(1 × 10 4 /以及)。离心机在百克1分钟,以启动细胞接触。 在37 ° C和5%CO 2 4小时。 轻轻移液100μLpipetter以均匀暂停释放的钙黄绿素混合的文化,在百克降速盘5分钟沉淀细胞和照顾,以避免气泡100μL上清转移到一个新的板块。任何弹出的气泡,可能会形成使用细针。 用荧光酶标仪(485 nm处激发滤光片,发射滤波器530 nm)读取的板块。底部阅读建议。 根据具体裂解百分比计算公式[(测试版自发释放)/(最大释放 – 自发释放)] × 100。 4。由RosetteSep NK细胞净化取外周血或扩大细胞,放入50 mL的管(100:1红细胞:PBMC)的100倍,多余的红细胞。 如果使用的新鲜红细胞直接进行下一步,如果在Alsever的解决方案中的红细胞计数,红细胞数量和洗适当(100倍超额)补充含2%FBS三次用PBS红细胞的数量,在1200转离心每次10分钟。 结合步骤1.7或在PBS 2.10步扩 ​​大细胞的外周血红细胞+ 2%胎牛血清的1毫升每5X10 7外周血或扩大细胞的最终体积。 添加RosetteSep1μL人类NK细胞富集外周血或扩大细胞每1 × 10 6鸡尾酒。 搅拌均匀,在室温下孵育20分钟,轻轻搅拌,每隔5分钟。 加入等体积PBS + 2%FBS混合轻轻上一层聚蔗糖 – 帕确顶部。 PBMC中隔离所述的聚蔗糖帕确离心重复步骤(第一节)。 计数净化后回收的NK细胞和预留5×105细胞通过流式细胞仪检测NK细胞纯度(步骤8)phenotpying。 5。注释 注意:1。NK细胞可扩大直接从外周血单个核细胞,或从RosetteSep纯化NK细胞。我们已经注意到了类似的扩张效率,但一些捐助者可能具有非常低的NK细胞数量,造成困难净化RosetteSep前扩张。 注2:我们经常使用的表型CD56 – FITC,CD16 – PE,CD3 – PE – Cy5的扩张期间,列举那些CD3阴性,CD16或CD56阳性的NK细胞。 注3:在每个媒体的变化或刺激,悬浮细胞在2.5 × 10 5 /毫升,以保持在或低于2万每毫升外周血单核细胞/ NK细胞数量扩张的高峰阶段。这将防止营养物质的耗竭,并帮助实现最大的扩张和生存。 注4。NK的扩张速度是捐助者的依赖,在刺激1或2的细胞可以被冻结的部分月底和部分进一步扩大,根据实验的需要。我们有很好的成功,在使用冷冻细胞在稍后的时间扩展。 注5:为了让错误的空间,我们建议使用最低 7×10 5 NK细胞重悬在700 ULS NKEM和4 × 5钙黄绿素- AM染色目标4 NKEM毫升悬浮细胞设立的细胞毒试验。如果使用播种靶细胞的细胞量较高(6毫升6×10 5),可能需要的基础上正在使用的大小媒体盆地多道移液器。也是推荐的NK细胞数量是专为E:T比例显示在协议中,使用更高的发送:T比率增加NK细胞每毫升相应的号码(例如:40:1发送:T比值使用4 × 6细胞/ ml) 注6:我们建议进行了初步的首选目标细胞株的滴定钙黄绿素- AM加载,使用以下1:500,1:400稀释。 1:300,1:200和1:100,实现最大的和自发的释放之间的最佳差异。 注7:当使用贴壁细胞系作为目标,先准备单细胞悬液,使用非酶细胞分解缓冲区。如果执行的ADCC,准备在CAM媒体重复管的靶细胞。 注8,如果执行的ADCC,添加相同的NK细胞,以3口井,对应10:1 E: 为 ADCC的T。重复更多的捐助者。重复额外的靶细胞。 注9:如果执行的ADCC实验,钙黄绿素装载45分钟后,添加诱导对靶细胞的ADCC的特定抗体10ug。 15多分钟后,靶细胞完全培养基清洗两次,5分钟1200转离心。悬浮细胞在1 × 10 5细胞/ mL,并在协议的下一步骤进行。 6。代表性的成果 图2当膨胀是按照计划进行上文所述,典型的NK细胞产生范围从1×10 9 10 10个细胞(捐助者的依赖变异)为起始原料,采用5×106外周血单个核细胞。图中显示NK细胞倍的扩张(N = 19)相比,在原有的产品中存在的NK细胞(中位数+ / – 四分位数)。 图3:扩大NK细胞表达不同的NK细胞受体与少数例外(CD11b表达,CD160和CD244)未展开的主要NK细胞相媲美的。 图4。外周血从Buffy大衣的恢复是捐助者的依赖,范围可以从300×10 6 800×10 6 。 NK细胞可占2% – 18%的外周血单个核细胞。 RosetteSep扩大细胞的纯化,回收纯NK细胞从40-70%14天范围。通过以下建议扩大和净化的协议,NK细胞纯度达99%,可以预期的。 图5。扩大NK细胞都表现出对肿瘤细胞株的范围,包括神经母细胞瘤,白血病,骨肉瘤和黑色素瘤(代表反洗钱杀害%的具体裂解所示)的细胞毒性。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者想感谢他们的工作,在创建初始K562 AAPC和mIL21融合向量劳伦斯库珀,Harjeet辛格和LENKA Hurton。

为这项工作提供了资金的UT MD安德森医师科学家计划,圣Baldrick的基金会,Friendswood的传奇。

Materials

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

  • 90% RPMI 1640 (Cellgro)
  • 10% Fetal Bovine Serum (Gibco)
  • 1x Penicillin / Streptomycin (Cellgro)
  • 1x L-Glutamine (Gibco)
    • Filter Sterilize media before use.
  • 50 U/ mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)
    • – Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.

PBMC and NK Cell Isolation

  • Ficoll-Paque (GE Healthcare)
  • Alsever’s solution (Sigma)
  • RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies)

NK Cell Cytotoxicity Assay

  • Calcein-AM (Invitrogen)
    • Stock solution is at 1mg/ mL, store frozen in 50 μL aliquots. Dissolve in NKEM media to achieve desired dilution for cell staining.

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below;

  Antibody Volume per Test Company Catalog number

Tube 1

Isotype FITC
Isotype FITC
Isotype FITC
Isotype FITC
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
80
100
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
555748
555749
557224
340442
Tube 2 CD56 FITC
NKp30 PE
NKp44 PE
NKp46 PE
CD3 PE-Cy5
CD16 Alexa 647
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
5
5
70
100
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
340410
558407
558563
557991
555341
557710
Tube 3 CD56 FITC
KIR2DL1 PE
KIR2DL2/3 PE
KIR3DL1 PE
CD3 PE-Cy5
NKG2D APC
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
5
5
70
100
BD Pharmingen
R&D Systems
Miltenyi Biotec
R&D Systems
BD Pharmingen
BD Pharmingen
340410
FAB1844P
130-092-618
FAB12251P
555341
558071
Tube 4 CD56 FITC
CD11b PE
CD3 PE-Cy5
CD27 APC
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
80
100
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
340410
555388
555341
558664
Tube 5 CD56 FITC
CD266 (DNAM-1) PE
CD3 PE-Cy5
CD160 Alexa647
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
80
100
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
eBiosciences
340410
559789
555341
51-1609-42
Tube 6 CD56 FITC
CD244 (2B4) PE
CD3 PE-Cy5
CD197 (CCR7) APC
FACS Buffer
Total Volume
5
5
5
5
80
100
BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Pharmingen
eBiosciences
340410
550816
555341
17-1979-42

References

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Cite This Article
Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540, doi:10.3791/2540 (2011).

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