Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans
Summary
Biofilms formados en la superficie de los dientes son muy complejas y expuestas a constantes desafíos ambientales innata y exógenos, que modulan su arquitectura, la fisiología y transcriptoma. Hemos desarrollado un conjunto de herramientas para examinar la composición, organización estructural y la expresión génica de los biofilms orales, que pueden adaptarse a otras áreas de investigación del biofilm.
Abstract
Los biofilms son muy dinámicos, las comunidades organizadas y estructuradas de las células microbianas inmersos en una matriz extracelular de la densidad y la composición variable de 1, 2. En general, los biofilms se desarrollan a partir fijación microbiana inicial sobre una superficie seguido por la formación de grupos de células (o microcolonias) y el desarrollo y la estabilización de las microcolonias, que se producen en una matriz extracelular complejo. La mayoría de los exopolisacáridos del biofilm matrices puerto (EPS), y las biopelículas dentales no son una excepción, especialmente los relacionados con la enfermedad de caries, que son en su mayoría mediada por estreptococos mutans 3. Las EPS son sintetizadas por los microorganismos (S. mutans, un contribuyente clave) por medio de enzimas extracelulares, tales como la sacarosa principalmente glucosiltransferasas utilizando como sustrato 3.
Estudios de biofilms formados en la superficie de los dientes son particularmente difíciles debido a su exposición constante a los problemas ambientales asociados con la dieta compleja microbiana de acogida interacciones que ocurren en la cavidad oral. Una mejor comprensión de los cambios dinámicos de la organización estructural y composición de la matriz, la fisiología y transcriptoma / profile proteoma del biofilm las células en respuesta a las complejas interacciones permitirían mejorar el conocimiento actual de cómo los biofilms orales modular patogenicidad. Por lo tanto, hemos desarrollado una caja de herramientas analíticas para facilitar el análisis del biofilm en los planos estructurales, bioquímicos y moleculares mediante la combinación de las técnicas comúnmente disponibles y la novela con hechos a medida de software para análisis de datos. Estándar de análisis (ensayos colorimétricos, RT qPCR y microarrays) y nuevas técnicas de fluorescencia (para el etiquetado simultánea de bacterias y EPS) se han integrado con un software específico para el análisis de datos para hacer frente a la compleja naturaleza de la investigación biofilm oral.
La caja de herramientas se compone de 4 pasos distintos pero conectados entre sí (Figura 1): 1) Los bioensayos, 2) datos primarios de entrada, 3) Procesamiento de Datos, y 4) Análisis de datos. Hemos utilizado nuestro modelo in vitro de biopelículas y condiciones experimentales para demostrar la utilidad y la flexibilidad de la caja de herramientas. El modelo de biofilm es simple, reproducible y múltiples repeticiones de un mismo experimento se puede hacer al mismo tiempo 4, 5. Además, permite la evaluación temporal, la inclusión de especies microbianas diversas 5 y la evaluación de los efectos de las distintas condiciones experimentales (por ejemplo, tratamientos de 6, la comparación de mutantes knockout contra la cepa parental 5; disponibilidad de hidratos de carbono 7). Aquí se describen dos componentes específicos de la caja de herramientas, incluyendo (i) un nuevo software para minería de datos de microarrays / organización (MDV) y el análisis de fluorescencia de imagen (DUOSTAT), y (ii) in situ EPS-etiquetado. También ofrecemos un caso experimental que muestra cómo la caja de herramientas puede ayudar con el análisis de biofilms, los datos de la organización, integración e interpretación.
Protocol
Discussion
En esta presentación, hemos demostrado dos componentes fundamentales de la caja de herramientas analíticas (EPS / bacterias de imágenes y datos de microarrays de minería / procesamiento), la versatilidad y utilidad de los diversos análisis integrado en el sistema. Claramente, la caja de herramientas facilita el análisis integral (comparativa) y simultánea de los distintos aspectos de la bioquímica de las biopelículas, la arquitectura y la expresión génica en respuesta a las diferentes condiciones experimental…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Gary Herbert Xie Lee y para el desarrollo de MDV. También queremos agradecer a los Dres. Simone Duarte, Murata Ramiro, Jeon Jae-Gyu, Abranches Jacqueline, y la Sra. Stacy Gregoire por su contribución científica y técnica de los componentes de análisis de la caja de herramientas. Este estudio fue apoyado en parte por la Beca de investigación USPHS DE018023 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
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