Forniamo un metodo per testare le varianti BRCA1 in un test di coltura di tessuti a base di ricombinazione omologa la riparazione del danno al DNA mediante deplezione delle proteine endogene BRCA1 da una cella con RNAi e la sua sostituzione con un mutante punto BRCA1 che contiene un cambio di codifica.
L'analisi funzionale di mutazioni missense può essere complicata dalla presenza nella cellula della proteina endogena. Struttura-funzione di analisi del BRCA1 sono state complicate dalla mancanza di un test affidabile per la proteina BRCA1 pieno lunghezza e le difficoltà insite nel lavoro con linee cellulari che esprimono proteine BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. Abbiamo sviluppato un sistema in cui la proteina BRCA1 endogena in una cella è stato acutamente impoverito da RNAi intese a promuovere l'3'-UTR del mRNA BRCA1 e sostituito da co-trasfezione un plasmide che esprime una variante del gene BRCA1. Un vantaggio di questa procedura è che il silenzio acuto di sostituzione BRCA1 e simultanea permettono alle cellule di crescere senza mutazioni secondarie o adattamenti che potrebbero sorgere nel corso del tempo per compensare la perdita della funzione del gene BRCA1. Questo impoverimento e add-back procedura è stata fatta in un HeLa derivate linea cellulare che è stato prontamente analizzati per attività di ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa test si basa su un metodo precedentemente pubblicato con il quale è integrato un substrato ricombinazione nel genoma (Figura 1), 6,7,8,9. Questo substrato ricombinazione ha il raro taglio I-SCEI sito enzima di restrizione all'interno di un allele inattivo GFP, ed è a valle un allele secondo GFP inattivo. Trasfezione del plasmide che esprime I-SCEI si traduce in un doppio filamento pausa, che può essere riparato per ricombinazione omologa, e se ricombinazione omologa fa riparare la rottura che crea un allele attivo GFP che è prontamente segnato mediante citometria di flusso per l'espressione della proteina GFP . L'esaurimento delle BRCA1 endogena comportato un 8-10-fold riduzione dell'attività ricombinazione omologa, e aggiungere-back di tipo selvaggio funzione plasmide ricombinazione omologa completamente restaurato. Quando mutanti specifico punto di BRCA1 lunghezza sono stati espressi dal co-trasfettate plasmidi, l'effetto della mutazione missense specifico potrebbe essere segnato. A titolo di esempio, l'espressione della (M18T) proteina BRCA1, una variante di significato clinico sconosciuto 10, è stato espresso in queste cellule, non è riuscito a ripristinare BRCA1-dipendente ricombinazione omologa. Al contrario, espressione di un'altra variante, anche di significato sconosciuto, BRCA1 (I21V) completamente restaurato BRCA1-dipendente funzione di ricombinazione omologa. Questa strategia di test della funzione di BRCA1 mutazioni missense è stato applicato a un altro sistema biologico dosaggio per la funzione centrosoma (Kais et al, osservazioni non pubblicate). Nel complesso, questo approccio è adatto per l'analisi dei mutanti missense in qualsiasi gene che deve essere analizzato recessiva.
Il vantaggio di questo metodo è che possiamo studiare la funzione della proteina BRCA1 nella regolazione della riparazione del DNA per ricombinazione omologa utilizzando cellule che hanno wild-type BRCA1 endogenamente espresso. Abbiamo adottato due metodi distinti costituiti di studiare il processo di ricombinazione omologa e di utilizzare l'RNAi mediato esaurimento per ottenere il nuovo metodo per il test per la funzione varianti BRCA1 nella riparazione del DNA. La chiave per il successo di questo metodo è stato quello di stabilire una linea di cellule facilmente transfectable, come ad esempio HeLa, con il substrato ricombinazione del genoma in modo tale che si ottengono livelli molto alti di conversione GFP. Avevamo proiettato più cloni della trasformazione originale al fine di ottenere uno che non aveva segnale rilevabile GFP fondo, ma dopo trasfezione delle I-SCEI plasmide di espressione aveva un livello molto elevato di conversione GFP.
Con questo metodo, ora stiamo studiando altri specifici residui di aminoacidi BRCA1 per la funzione di ricombinazione omologa. Insieme con la intuizioni biologico da questo lavoro, queste conclusioni possono essere applicate alla genetica clinica sul cancro. Un'alta percentuale di BRCA1 mutazioni missense sono sconosciute significato clinico poiché ci sono molte varianti rare e non ci sono informazioni sufficienti per molte di queste per determinare l'associazione del cancro attraverso l'analisi di segregazione genetica 3,10,13,14. Utilizzando questo metodo, le conseguenze di una variante specifica per la funzione biologica di BRCA1 nella regolazione della ricombinazione omologa potrebbero essere utilizzati per informare le donne che svolgono una di queste varianti nel loro genoma.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati allo Stato dell'Ohio Centro Comprehensive Cancer dell'Università per il finanziamento per questo lavoro.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |