这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano<em>等。</em>(2007年)。线粒体的分离过程中需要约2小时。线粒体呼吸在大约1个小时就可以完成。
线粒体是细胞器控制细胞死亡的生命和。他们参与重要的代谢反应,合成的ATP,规范的信号级联 2,3 。过去和目前研究人员已经从大鼠和小鼠的组织,如肝,脑和心脏4,5中分离出线粒体。近年来,许多研究人员都集中在研究从骨骼肌线粒体功能。
在这里,我们描述了,我们已经成功地用于从 6骨骼肌线粒体隔离的方法。我们的程序要求,所有的缓冲液和试剂都取得了新的和需要约250-500毫克骨骼肌。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌和隔膜中分离出线粒体,鼠眼外肌。线粒体蛋白浓度测定Bradford法。重要的是保持在编制和功能的研究是一个相对较短的时间(约1小时)内进行线粒体样品冰冷。线粒体呼吸是用一个克拉克型电极(Oxygraph系统)在37 ° C 7极谱。氧电极的校准是在本议定书中的关键一步,它每天必须执行。隔离线粒体(150微克)被添加到实验缓冲液(EB)0.5毫升。国家2呼吸开始,除谷氨酸(5MM)和苹果酸(2.5毫米)。然后,二磷酸腺苷(ADP)(150微米)被添加到启动状态3。寡(1μM),ATP酶合成酶阻断剂,用于估计状态4。最后,羰基氰化物的P -三氟甲氧基] -苯基腙(FCCP,0.2微米)添加到measurestate 5,或耦合呼吸 6 。呼吸控制率(RCR),状态3状态4的比例,计算后,每一个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。
总之,我们目前的隔离,可用于生化(例如,研究酶的活性,免疫检测,蛋白质组学)和功能(线粒体呼吸)的骨骼肌线粒体可行的方法。
我们提出了一个协议孤立可行的骨骼肌线粒体。如果收益率是一个问题,该协议可以修改孵化5毫升30分钟,在冰PBS/10mM EDTA/0.01%胰蛋白酶的孤立肌肉。为了保证胰蛋白酶完成肌肉消化,肌肉需要充分剁碎。 PBS/10mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液孵育30分钟后,必须完全取代隔离缓冲区1(IB1)3毫升。此外,使用胰蛋白酶,可能会干扰线粒体呼吸协议中的一些基板。这一协议处于良好的使用胰蛋白酶时线粒?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由一个由美国国家眼科研究所(R01 EY12998)授予FH安德拉德支持。