我们的报告负选择系统的发展<em> E。阿米巴</em>基于嵌合蛋白的转基因表达(FCU1)和前体药物5 – 氟胞嘧啶的选择。 FCU1蛋白是一种融合酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶phosphoribosyltransferase。 FCU1表达导致增加<em> E。阿米巴</em>对5 – 氟胞嘧啶的敏感性。
阿米巴的阿米巴病的病原体和感染世界人口的10 %。已启用上和基因表达调节的分子生物学技术,依靠稳定保持质粒转染。虽然这些都增加了阿米巴致病因素的认识,能力整合到基因组,这将使反向遗传学实验,将在研究这种寄生虫的一个显着的优势外源DNA。这个有机体提出的挑战,包括无法选择同源重组事件和难以治愈episomal质粒DNA转染滋养体。后来的结果在一个高的背景外源DNA,在重大问题确定一个真正的基因整合事件发生滋养体。我们的报告基于转基因表达的酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶嵌合体(FCU1)和前体药物5 – 氟胞嘧啶(5 – FC)选择的负选择系统的发展。 FCU1酶转换成有毒的5 -氟尿嘧啶和5 -氟- 5' -磷酸。E.的无毒的5 – FC 阿米巴线表示FCU1被发现30倍以上敏感的前体药物的对照菌株相比。
虽然已经有阿米巴的分子生物学工具的重大进展,有没有可用的电流的方法,删除或破坏基因4。特异表达的基因敲除已取得使用发夹RNA的5,小干扰RNA 6和细菌表达的dsRNA 7。然而,这些方法有效,同时为各自的靶基因,有一些局限性,包括昂贵的化学品的使用,对抗生素的连续选择和需要不断验证,由于高发病率的回归,随着时间的推移发生(艾丽西亚林福德,个人通信)8。
质粒可以复制在溶有显然不是一个严格的时序要求的DNA复制的起源9,所以一旦转,它通常是难以治愈的质粒。这限制了可能使用完整的质粒在重组和基因敲除实验。负选择标记基因的定位方法,因为它们可以被用来消除重组亚群的关键组成部分。我们已经成功地表达了密码子优化FCU1 阿米巴的基因,并测试其潜在的负选择标记。此融合基因已被用于人类肿瘤细胞的自杀基因治疗和代谢成有毒下游产品造成抑制RNA和DNA的合成 10的前体药物5 – FC 。 FCU1最近一直使用负选择标记,另一种原生动物寄生虫疟原虫疟原虫细胞表达FCU1被发现近1000倍更加敏感, 在体外和体内治疗药物前体5 – FC超过99.9%的死亡重组寄生虫感染疟疾11红细胞阶段的小鼠模型。 E. 阿米巴细胞表达FCU1表明在P 中观察到的敏感性只有30倍的前体药物5 – FC的敏感性增加疟原虫 。可能的原因可能与有毒代谢产物的竞争中成长中等核苷酸的大型游泳池。
在两个体育疟原虫和P.恶性疟原虫的FCU1标记已被用于有针对性的基因破坏。研究11,12。我们的目标是操纵阿米巴基因组同源重组。验证FCU1/5-FC负选拔制度是实现这一目标迈出的重要一步。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢为我们提供FCU1基因序列与菲利普Erbs博士。这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予的AI 26649。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |