Трансфекции правам нервные стволовые клетки с Amaxa Nucleofector
Summary
Введение гена в клетку является мощным средством для выяснения его функции в живом организме. Этот протокол описывает эффективный метод трансфекции культуры человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) с использованием аппарата Nucleofector электропорации сделанные Amaxa.
Abstract
Трансфекция первичных нервных клеток млекопитающих, таких как человеческий нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), с часто используемыми катионных реагентов трансфекции липидного часто приводит к ухудшению жизнеспособности клеток и низкой эффективности трансфекции. Другие механические способы введения гена, таких, как пушка гена или микроинъекции, также ограничены плохой выживаемости клеток и небольшого числа трансфекции клеток. Стратегия использования вирусных конструкций ввести экзогенных генов в первичных клеток сдерживается как количество времени и труда, необходимые для создания вирусных векторов и потенциальные проблемы безопасности. Мы описываем здесь шаг за шагом протокол для трансфекции hNSPCs использованием Nucleofector устройство Amaxa и технологии с электрическим током параметров и буферных растворов, специально оптимизированных для трансфекции нервные стволовые клетки. Используя этот протокол, мы достигли начальной эффективности трансфекции ~ 35% и ~ 70% после стабильной трансфекции. Протокол подразумевает объединение большого числа hNSPCs с ДНК для трансфекции в соответствующий буфер следуют электропорации с Nucleofector устройства.
Protocol
Discussion
Этот протокол описывает сравнительно быстрого и эффективного трансфекции процедура hNSPCs. Используя эту процедуру, мы получили начальные эффективность трансфекции ~ 35%. Клетки трансфекции с помощью этой процедуры можно использовать для краткосрочных исследованиях (временно трансфекции клеток) и?…
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов в Детской больнице с, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
