Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Kryokonservierung und Auftauen der kortikalen Hirngewebe Blöcke zu hoch angereicherten neuronalen Kulturen zu generieren. Dieses einfache Protokoll bietet Flexibilität für die spätere Generation von neuronalen, Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen.
In dieser Studie skizzieren wir ein standardisiertes Protokoll für die erfolgreiche Kryokonservierung und Auftauen der kortikalen Hirngewebe Blöcke zu hoch angereicherten neuronalen Kulturen zu generieren. Aus diesem Protokoll das Einfrieren Medium verwendet wird 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) in Buffered Salz Hanks Solution (HBSS) verdünnt. Blocks der kortikalen Gewebe sind Kryoröhrchen mit dem Einfrieren Medium überführt und langsam bei -1 ° C / min in einer Rate-kontrollierten Einfrieren Behälter eingefroren. Post-Tau-Verarbeitung und Dissoziation von gefrorenen Gewebe-Blöcke konsequent produziert neuronalen angereicherte Kulturen, die eine schnelle neuritischen Wachstum in den ersten 5 Tagen in Kultur und wesentliche Erweiterung des neuronalen Netzwerks ausgestellt innerhalb von 10 Tagen. Immunzytochemische Färbung mit den Astrozyten-Marker sauren Gliafaserproteins (GFAP) und die neuronalen Marker beta-Tubulin-Klasse III zeigte eine hohe Zahl von Neuronen und Astrozyten in den Kulturen. Generierung von neuralen Vorläuferzellen Zellkulturen nach Gewebe blockieren Dissoziation führte rasch expandierenden Neurosphären, die eine große Anzahl von Neuronen und Astrozyten differenzieren unter Bedingungen hergestellt. Diese einfache Kryokonservierung Protokoll ermöglicht die schnelle, effiziente und kostengünstige Erhaltung der kortikalen Hirngewebe Blöcke, die mehr Flexibilität für die spätere Generation von neuronalen, Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen gewährt.
Kryokonservierung bietet die Möglichkeit, Bank kostbaren Gehirn Gewebeproben für eine spätere Verwendung. Hier beschreiben wir eine einfache, aber effektive Protokoll sowohl Neuron-angereicherten Kulturen und neuronale Vorläuferzellen aus gefrorenem Hirngewebe Blöcke zu generieren. Dieses wirtschaftliche Verfahren vermeidet die Kosten der traditionellen Kryokonservierungstechniken, die teurer Rate-kontrollierten Tiefkühltruhen zu nutzen. Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung von lebensfähigen neuronalen Kulturen post-Auftauen, indem sie eine schnelle, aber effektive Mittel, um Gewebe-Blöcke einfrieren. Die gesamte Einfrieren Prozess kann so wenig wie 20 Minuten. Neben primären neuronalen Kulturen, kann mit dieser Methode Gewebeblöcke auch aufgetaut NPCs als frei schwimmende Neurosphären gewachsen zu generieren. In dieser Hinsicht stellt der Mangel an Serum in unserer Einfriermedium, dass die Zellen in einem undifferenzierten Zustand erhalten bleiben. Unter differenzierenden Bedingungen produziert Neurosphären aus gefrorenem Gewebe zeigen Expansion und Differenzierung Preise sehr vergleichbar Neurosphären aus frischem Gewebe erzeugt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel aus dem Undergraduate Research Opportunities Program an der UCI (AR und SP) und Zuschüsse aus dem US-Bundesstaat Kalifornien Alzheimer-Initiative und die National Institutes of Health Grant No unterstützt. HD38466 und Alzheimer Research Center keinen Zuschuss. AG16573 (JB)
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X | |
Bovine calf serum supplemented | HYCLONE | SH30072.03 | For culture medium | |
Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | ||
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium | |
Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation | |
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4527-30KU | Tissue dissociation | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium | |
Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells | |
antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination | |
Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fischer Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells | |
Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific | 1111-2721 | ||
21 G1 precision guide needles | Beckton Dickinson | 305165 | To clean tissue | |
10 ml pipette | USA Scientific | 1071-0810 | Individually wrapped | |
50 ml tubes | USA Scientific | 926-9-04 | ||
Single edge razor blade | Smith Brand | 67-0238 | To chop tissue | |
60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | For general culture | |
100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0010 | For cleaning tissue | |
Cryogenic box | NALGENE Labware | 5026-1010 | ||
Freezing container | NALGENE Labware | 5100-0001 | “Mr. Frosty” | |
2.0 ml cryogenic vials | NALGENE Labware | 5012-0020 | ||
DMSO | Fischer Scientific | D128-500 | For freezing medium | |
Ethanol 200 proof | Sigma | E7023 | For sterilizing razor blade |