このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。
海馬と皮質ニューロンは、中枢神経系(CNS)神経偏光、軸索/樹状突起伸長、およびシナプス形成と機能を研究するために広く使用されている。培養の利点は、これらのニューロンは非常に低密度で二次元の基板上に、独特の軸索と樹状突起を形成し、それらが容易に分極することです。このプロパティは、神経発達の多くの側面を決定するため、それらは非常に便利なてきた。さらに、これらのニューロンのためのグリアコンディショニングを提供することによって、彼らは機能的なシナプス結合を形成し、文化の中で数ヶ月間生存し、発展していきます。このプロトコルでは、文化とトランスフェマウス胎児海馬と皮質の神経細胞を分析する手法の概要を示します。トランスフェクションは、nucleofectionを経由してめっきする前に、神経細胞にDNAをelectroporatingことによって達成される。このプロトコルは、偏光、軸索伸長と分岐の間に蛋白質のダイナミクスと機能を研究するために開発(〜4 8時間メッキ後)の初期の蛍光タグ融合タンパク質を発現できるという利点があります。我々はまた、メッキの前に、この単一のトランスフェクションは、ニューロン(文化の中で> 2ヶ月)の生涯を通してイメージングのための適切なレベルで蛍光タグ融合タンパク質の発現を維持することを発見した。したがって、この方法論は、神経機能のほとんど、またはまったく中断して中枢神経系の開発を通して蛋白質の局在と機能を研究するために有用です。
培養胚の海馬と皮質のマウスニューロンのためのこのプロトコルは、ラットの神経細胞の1,2を使用してバンカーのプロトコル、の修正として開発されました。我々はよく3,4,5,6,7として培養マウスとハムスターのニューロンのためにこのプロトコルを使用している。このプロトコルは、海馬と新皮質の両方に神経細胞にも同様に機能し、Mebergとミラー8によって発行されたプロトコルに似ています。彼らはよく特徴付けと、より確立されたモデル系されているため、一般的に、我々は、長期培養のために海馬ニューロンを使用してください。さらに、彼らは新皮質よりもニューロンのより均質な集団を含む可能性があります。しかし、このプロトコルを使用して培養大脳皮質ニューロンも生き残ると(未発表データ)も同様に区別する。我々は日常的に短期の文化のために海馬と新皮質の神経細胞を使用してください。新皮質の解剖はまた、西洋例えば、ブロッティングのための材料のよりよい選択肢と海馬解離(海馬のペアごとに2.5×10 5ニューロン)、より実質的により多くのニューロン(皮質のペアごとに1.5 × 10 6ニューロン)をもたらす。
任意の初代培養と同様に、それが動物の死から細胞をプレーティングするのにかかる時間を最小限に抑えることが不可欠です。それは一般的に解剖し、メッキで一貫して高速になるために10月20日解剖がかかります。それらはnucleofectionバッファに残っている場合、ニューロンの生存率が急激に減少するとしても、ロンザNucleofectorで作業する場合、それは、エレクトロポレーションの手順の間に素早く作業することが重要です。
私たちの撮影の多くは、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)で行われている。顕微鏡のこのタイプは、カバースリップを超えたイメージング数百ナノメートルのみが可能です。したがって、我々は頻繁に画像そのニューロンの領域は、軸索成長円錐と樹状突起棘は、カバースリップに直接付着する必要があります。従って、我々は、長期培養のためにグリア栄養を必要とする低密度培養を使用してください。我々は、長期培養のために、グリアフィーダー層なしで、高密度培養(> 2 × 10 4細胞/ cm 2)を使用し、それらが少し餌と非常によく生き残ることを発見した。それらは容易に広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で検出することができるが、しかし、これらのニューロンの樹状突起は、しばしば、あまりにも遠く離れて基板からTIRFMの画像になります。
我々の研究のほとんどでは、メッキの前に神経細胞をトランスフェクトし、文化の3ヶ月までのための蛍光標識タンパク質を画像化している。蛍光標識タンパク質のこの長期的な発現は、DNA(1 -2μg)の低濃度を使用することによって我々は神経細胞で過剰発現のアーティファクトを生成していないことを私たちに自信を与えます。しかし、この手順は、DNAの大量(10 -20μg)を使用する場合、タンパク質の過剰発現を研究するために使用することができます。我々はまた、単独でDsRed2のまたはEGFPを持つ神経細胞質にラベルを付けるものの、我々は通常、神経細胞をトランスフェクトするために使用するプラスミドは、EGFPまたはmCherry融合タンパク質が含まれています。このエレクトロポレーション法は、ベクトルの数とうまく動作します。我々は、CMVエンハンサーとβ-グロビンポリ- expressionの比較的高いレベルのために尾(pCAGGsまたはpCAXプラスミド)9、、と彼らはよく神経細胞によって許容されるという事実とβ-アクチンプロモーターを含むプラスミドを好む短期と長期培養の両方インチ一般に、タンパク質はメッキの約4時間以内に発現し、10 24 10内イメージングのための十分なレベルに到達し始める。私たちは正常に短期培養におけるCMV -プロモーター駆動型プラスミドを用いているが、彼らは長期培養で神経細胞を殺すことに過剰発現の高いレベルを引き起こすことを見出した。それにもかかわらず、我々は、低密度培養のグリアコンディショニングがより高い密度(非グリアFED)の文化と比較して、CMV -プロモーター駆動プラスミドをトランスフェクトした神経細胞の生存に役立つことを発見した。
The authors have nothing to disclose.
すべての手順は、アニマルケアのウィスコンシン委員会の大学によって承認され、NIHのガイドラインに従ってであった。私たちは、彼女のNucleofector装置の寛大な使用のために博士はキャサリンカリルに感謝。我々は、プロトコル上のコメントのデントラボのメンバーにも感謝。この作品は、EWDへの助成金NIH R01 – NS064014、ダナ財団とホワイトホール財団によってサポートされていました
クリストファーViesselmann、ジェイソンBallwegとデレクLumbardはこの論文にも同様に貢献した。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.