Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.
Abstract
İzolasyon, enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında santral sinir sistemi (MSS) sızmak bağışıklık hücreleri, sık sık fenotip ve efektör fonksiyonları tanımlamak için gereklidir. Histokimyasal yaklaşımlar infiltre hücrelerin yerini belirlemek ve patoloji ilişkili MSS analiz etmek için enstrümantal. Ancak, in-situ histokimyası ve immunofluorescent boyama teknikleri belirli bir doku immün hücre alt tiplerinin karakterize etmek için bir kez kullanılabilir antikor sayısı ile sınırlıdır. Bu nedenle, bağışıklık fenotipleme flow sitometri ile birlikte histolojik yaklaşımlar tamamen yerel MSS infiltrasyon kompozisyon karakterize etmek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, süreksiz Percoll gradyanları üzerinde MSS hücresel süspansiyonlar ayrılması dayanmaktadır. Mevcut makalede, verimli, flow sitometri ile tek bir örnek, çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının belirlenmesi için etkin bir şekilde kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.
Protocol
Reaktiflerin hazırlanması Ca olmadan bir bölümünü 10X HBSS Percoll 9 parça karıştırılarak stok izotonik Percoll (SIP), beyin başına 4 ml, hazırlama + + ve Mg + +. 1X HBSS% 70 olmadan SIP hazırlayın Ca + + ve Mg + +, 2 ml, 15 ml polipropilen konik tüp boşaltılan beyin başına. Not: Percoll oda sıcaklığında kullanılması gerektiğini tavsiye edilir, soğuk kullanılması halinde, hücreler gelme eğilimindedirler …
Discussion
1-3 birkaç on yıl için, normal ve iltihaplı fare dokulardan MSS lökosit hücre yüzey belirteçlerinin analizi kullanılmıştır . İzolasyon protokolleri yoğunluğu santrifüj 4 mikroglia ve lökositlerin ayrılık dayanır. Burada izole MSS lökosit süreksiz Percoll gradyanlar kullanarak hızlı ve etkin bir yöntem açıklanmaktadır. , CD4, CD8, CD11b, CD19, vb gibi çeşitli antikorlar ile boyanarak hücre izolasyonu sonra, as-ama-CD45 sınırlı değil, belirli bir patoloji indüksiyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz Derneği (TA AEC 3021-A1 / T) ve University of Texas at San Antonio tarafından desteklenmiştir.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Percoll (Amersham)
10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
Cell Staining Buffer (Biolegend)
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).