Summary

Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

Published: October 18, 2010
doi:

Summary

Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble du<em> Salmonella</em> En utilisant la fluorescence<em> In situ</emL'hybridation> (FISH).

Abstract

Ce protocole décrit une méthode simple pour les adhésifs à base de bandes d'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivi par le bande hybridation fluorescente in situ (FISH) pour rapidement indépendante de la culture de détection de Salmonella spp. Cell-bandes chargées peuvent également être placées face cachée sur une gélose sélective pour l'enrichissement en phase solide avant la détection. Alternativement, les enrichissements de liquide de faible volume (miniculture surface du liquide) peut être effectuée sur la surface de la bande dans un bouillon non sélectif, suivis par les poissons et l'analyse par cytométrie en flux. Pour commencer, ruban adhésif stérile est mis en contact avec des produits frais, une légère pression est appliquée, et la cassette est retirée, extraire physiquement les microbes présents sur ces surfaces. Les bandes sont montées collant vers le haut sur des lames de microscope en verre et les cellules prélevées sont fixés avec du formol à 10% (30 min) et déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol à (50, 80 et 95%; 3 min de chaque concentration). Ensuite, la cellule chargée des bandes sont repérés avec le tampon contenant un cocktail de Salmonella ciblées sonde ADN et hybrides pour les 15 – 30 min à 55 ° C, suivi par un bref rinçage dans un tampon de lavage pour enlever la sonde non liée. Adhérents, FISH cellules marquées sont ensuite contre-colorées avec de l'ADN de teinture 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les résultats sont considérés en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour en phase solide enrichissement, la cellule chargée des bandes sont placées face cachée sur une surface de gélose sélective adaptés et mis en incubation pour permettre la croissance in situ des microcolonies Salmonella, suivis par les poissons et la microscopie comme décrit ci-dessus. Pour miniculture surface du liquide, la cellule chargée des bandes sont placées côté collant et une chambre de perfusion de silicone est appliqué de telle sorte que le ruban et la forme de la lame de microscope fond d'une chambre étanche dans laquelle un petit volume (≤ 500 pi) de trypticase soja Bouillon (BST) est introduit. Les ports d'entrée sont fermées et les chambres sont incubées à 35 – 37 ° C, permettant une croissance basée sur l'amplification de la bande-extrait de microbes. Après incubation, les ports d'entrée sont descellés, les cellules sont détachées et mélangées avec le dos vigoureuse-et-vient de pipetage, récolté par centrifugation et fixés dans 10% du formol tamponné neutre. Enfin, les échantillons sont hybridés et examiné par cytométrie en flux pour révéler la présence de Salmonella spp. Comme il est décrit ici, notre "bande-FISH» approche peut fournir d'échantillonnage simple et rapide et la détection de Salmonella sur des surfaces de tomates. Nous avons également utilisé cette approche pour l'échantillonnage d'autres types de produits frais, y compris les épinards et les piments jalapeño.

Protocol

1. L'échantillonnage de surface avec du ruban adhésif stérile Sélectionnez une bande à utiliser pour l'échantillonnage. Le commerce des champignons-Tape ou Con-Tact-Il bandes d'échantillonnage sont stériles et spécialement conditionnés pour la facilité d'utilisation. Toutefois, nous avons constaté que la transparence (optiquement clair) de bandes de bureau génériques peuvent également être utilisés. Utilisez un marqueur indélébile pour dessiner des carrés de 1 cm …

Discussion

Des méthodes simples et rapides pour la détection des pathogènes sur des surfaces de produire peut aider à atténuer les maladies d'origine alimentaire en fournissant des données pertinentes et appropriées. Adhésif méthodes d'échantillonnage basés sur la cassette ont été utilisés dans l'environnement, clinique et de microbiologie alimentaire depuis les années 1950 et impliquent appuyant sur "Scotch" style de bande à des surfaces pour l'élimination des microorganismes, suivi par …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le financement de ce travail a été fourni par une croissance Iowa Fonds du Prix Valeurs à BFBS.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fungi-Tape sampling tape   Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape   Birko Corporation, Denver, CO   http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic   Various suppliers   Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface   Local grocery   Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth   Difco, Sparks, MD 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base   Difco, Sparks, MD 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement   Difco, Sparks, MD 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes   Various suppliers   RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA    
NaCl solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes   Integrated DNA Technologies, Coralville, IA   5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge   Various suppliers   Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber   Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station   Various suppliers   Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)   Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope   Various suppliers   Leitz Laborlux S used here
Digital camera   Various suppliers   Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software   Various suppliers   Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop   Adobe Inc.   For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer   Various suppliers   FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software   Various suppliers   FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

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Cite This Article
Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

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