We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale transductie
T-cel-receptoren (TCRs) spelen een centrale rol in het immuunsysteem. TCRs op T-cel oppervlakken kunnen herkennen specifiek peptide-antigenen gepresenteerd door antigeen presenterende cellen (APC's) 1. Deze erkenning leidt tot de activatie van T-cellen en een reeks van functionele uitkomsten (bv. cytokine productie, het doden van de doelwitcellen). Inzicht in de functionele rol van TCRs is van cruciaal belang om de kracht van het immuunsysteem harnas aan een verscheidenheid van immunologie gerelateerde ziekten (zoals kanker of auto-immuniteit) te behandelen.
Het is handig om TCRs in muis modellen, die kan worden bereikt op verschillende manieren te bestuderen. Het maken van TCR transgene muis modellen is duur en tijdrovend en momenteel zijn er slechts een beperkt aantal van hen beschikbaar 2-4. Als alternatief, muizen met antigeen-specifieke T-cellen kan worden gegenereerd door het beenmerg hersenschim. Deze methode neemt ook een aantal weken en vereist expertise 5. Retrovirale transductie van TCRs in in-vitro-geactiveerde muis T-cellen is een snelle en relatief eenvoudige methode om T-cellen van de gewenste peptide-MHC specificiteit te verkrijgen. Antigeen-specifieke T-cellen kunnen worden gegenereerd in een week en gebruikt in een afgeleide toepassingen. Studeren getransduceerde T-cellen ook rechtstreeks van toepassing voor de menselijke immunotherapie heeft als adoptieve overdracht van menselijke T-cellen getransduceerd met antigeen-specifieke TCRs is een nieuwe strategie voor de behandeling van kanker 6.
Hier presenteren wij een protocol om retrovirally TCRs transduceren in in-vitro-geactiveerde muis T-cellen. Zowel de mens en muis TCR genen kunnen worden gebruikt. Retrovirussen die specifieke TCR-genen worden gegenereerd en gebruikt om de muis T-cellen geactiveerd met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen infecteren. Na in vitro expansie, getransduceerde T-cellen worden geanalyseerd door middel van flow cytometrie.
Verschillende stappen zijn cruciaal voor een optimaal resultaat te bereiken. Plat-E verpakking cellijn moet worden bewaard in een gezonde conditie. Indien nodig, kunnen de cellen worden gepasseerd een paar keer in DMEM medium met 1 ug / ml puromycine, 10 ug / ml blasticidine om het verlies van retrovirale structuur eiwitexpressie te voorkomen. Op de dag van de transfectie, moeten de cellen worden ~ 80% confluent. Te weinig of te veel cellen kan het virus titer. Het virus kwaliteit kan worden gecontroleerd door het testen op cellijnen die gemakkelijk kunnen worden getransduceerd. Sinds TCRs nodig CD3 complexen worden uitgedrukt op het celoppervlak, we routinematig gebruik van 58α-/β- hybridoomcellen 10 (een cellijn die niet uitdrukken endogene TCR α of β-keten, maar wel express CD3 complex). We krijgen bijna 100% transductie-efficiëntie van de hybridoma-cellen bij de transducing cellen met 1 ml van het virus supernatant. Ten slotte is de T-cellen moeten worden geactiveerd en prolifererende omdat retrovirus kan alleen infecteren actief delende cellen.
De hier gepresenteerde methode voor de productie van antigeen-specifieke T-cellen heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is het moeilijk om 100% transductie-efficiëntie te bereiken voor de primaire muis T-cellen. Een deel van de cellen niet tot expressie van de TCR van belang. Ten tweede, de getransduceerde TCR α-en β-ketens kunnen mispair met endogene TCRs 9, die expressie van de TCR van de rente. Daarnaast kan de mispaired TCRs veroorzaken auto-immuniteit in vivo 11. Tot slot is er slechts een beperkt tijdsbestek de getransduceerde T-cellen kunnen worden gebruikt. Na ongeveer een week, de cellen ondergaan apoptose, tenzij opnieuw worden gestimuleerd. Echter, kunnen cellen uitgeput raken en verliezen functies met repetitieve re-stimulatie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (5U01CA137070) en de American Cancer Society (RSG-09-070-01-LIB), een Cancer Research Institute Investigator Award (MK), een American Heart Association pre-doctorale beurs (KM) en een Spaanse ministerie van Onderwijs en Wetenschappen Fellowship (APG).
We willen graag het bedanken Dr Nicholas Restifo en Dr Zhiya Yu (NIH / NCI) voor de nuttige suggesties aan het protocol.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).