Triagem de mutantes com defeitos fenotípicos é um método simples para identificar genes que funcionam em um determinado processo biológico. Neste artigo vamos descrever como worms cultura livre vivos (por exemplo,<em> Pristionchus pacificus</em>) No laboratório e mostrar dois métodos diferentes mutagênese, EMS e TMP UV /.
Abstract
Este protocolo descreve os procedimentos para manter a nematóides em laboratório e como induz mutações los usando dois métodos alternativos: o metano sulfonato de etila (EMS) e 4, 5, 8-trimethylpsoralen combinada com luz ultravioleta (TMP / UV). Nematóides são poderosos sistemas biológicos para estudos genéticos por causa de seu plano corporal simples e sistema de acasalamento, que é composto de auto-fertilização hermafroditas e homens que podem gerar centenas de descendentes por animal. Nematóides são mantidos em placas de ágar contendo um gramado de bactérias e podem ser facilmente transferidos de uma placa para outra usando uma picareta. EMS é um agente alquilante comumente usado para induzir mutações pontuais e pequenas deleções, enquanto TMP / UV induz principalmente exclusões. Dependendo da espécie de nematóide sendo usado, as concentrações de EMS e TMP terá que ser otimizado. Para isolar mutações recessivas do nematóide pacificus Pristionchus, os animais da geração F2 foram selecionados para fenótipos visualmente. Para ilustrar esses métodos, mutagenizados worms e olhou para a falta de coordenação (Unc), Dumpy (DPY) e Transformer (Tra) mutantes.
Protocol
Parte 1: Preparando o crescimento da mídia nematóide (NGM) placas de Petri Nematóides experimentais como C. elegans e P. pacificus são normalmente cultivadas em laboratório em 6 placas de Petri contendo meio centímetro Nematóides do Crescimento (NGM) 1. Worms são mantidos a 20 ° C, mas pode ser incubado a uma gama de temperaturas (entre 4 ° C – 25 ° C), dependendo da espécie de nematóides e design experimental. Para preparar pratos com NGM, standard t?…
Discussion
Mutagênese é uma técnica amplamente empregada para estudos genéticos em vários organismos modelo experimental. Experimentos de mutagênese são freqüentemente usados para identificar a função de um gene 2. Os procedimentos de mutagênese descritos aqui podem ser usados não apenas para P. pacificus, mas também para C. elegans e de outras espécies de nematóides relacionados. Aqui nós descrevemos dois métodos, EMS e TMP / UV mutagênese.
EM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela NSF conceder IOB # 0615996.
Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293, doi:10.3791/2293 (2011).