In deze video laten we zien hoe een geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron opgenomen in de whole cell configuratie in hersenen van de rat plakjes. Deze techniek heet de dynamische klem.
Neurowetenschappers onderzoek naar de functie van de hersenen door te onderzoeken hoe neuronen in de hersenen communiceren. Veel onderzoekers kijken naar veranderingen in de elektrische activiteit van een of meer neuronen in reactie op een experimenteel-gecontroleerde input. De elektrische activiteit van neuronen kan worden opgenomen in geïsoleerde hersenen plakjes met behulp van patch clamp technieken met glas micropipetten. Traditioneel, experimentatoren kunnen neuronale ingang na te bootsen door middel van directe injectie van stroom door de pipet, elektrische stimulatie van de andere cellen of de resterende axonale verbindingen in de slice, of farmacologische manipulatie door receptoren die zich op de neuronale membraan van de cel opgenomen.
Gelijkstroom injectie heeft de voordelen van het passeren van een vooraf bepaalde stroomvorm met een hoge temporele precisie op de plaats van de opname (meestal de soma). Dit betekent echter niet verandert de weerstand van de neuronale membraan zoals ion kanalen geen fysiek worden geopend. Huidige injectie heeft meestal rechthoekige pulsen en dus niet het model van de kinetiek van ionkanalen. Tot slot kan de huidige injectie niet na te bootsen de chemische veranderingen in de cel die zich voordoet bij de opening van ionkanalen.
Receptoren kunnen fysiek worden geactiveerd door elektrische of farmacologische stimulatie. De experimentator heeft een goede temporele precisie van de receptor activering met elektrische stimulatie van de slice. Echter, er is beperkte ruimtelijke nauwkeurigheid van de receptor activering en de precieze aard van wat wordt geactiveerd bij stimulatie is onbekend. Dit laatste probleem kan gedeeltelijk worden beperkt door specifieke farmacologische middelen. Helaas, het tijdsverloop van de activering van farmacologische middelen is meestal langzaam en de ruimtelijke precisie van inputs op de opgenomen cellen is onbekend.
De dynamische clamp techniek kan een onderzoeker om de huidige instelling doorgegeven direct in de cel op basis van real-time feedback van de membraanpotentiaal van de cel (Robinson en Kawai 1993, Sharp et al., 1993a, b;. Voor het overzicht, zie Prinz et Al. 2004). Hierdoor kan een onderzoeker van de elektrische veranderingen die zich voordoen op de plaats van de opname na te bootsen in reactie op de activering van een receptor. Real-time veranderingen in de toegepaste stroom wordt bepaald door een wiskundige vergelijking geïmplementeerd in hardware.
We hebben kort geleden heeft gebruikt de dynamische clamp techniek om de generatie van de uitbarstingen van actiepotentialen onderzoeken door fasisch activatie van NMDA-receptoren in de dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009;. Lobb et al., 2010.). In deze video, tonen we de procedures die nodig zijn om een NMDA receptor geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron.
De dynamische clamp techniek hier gedemonstreerd verbetering ten opzichte van de traditionele techniek van directe inspuiting huidige doordat de experimentator om de elektrische effecten van de activering van een receptor na te bootsen. In deze video, hebben we laten zien dat men de effecten toe te voegen van de activering van een NMDA-receptor op de spontane activiteit van de dopaminerge neuron, dat wil zeggen een uitbarsting van actiepotentialen worden opgewekt.
Door de flexibiliteit van de hardware / software implementatie, kan een scala aan uitbreidingen worden gebruikt. Het teken van de geïnjecteerde stroom kan worden omgeschakeld van negatief naar positief, wat neerkomt op een scenario waarin de effecten van de geactiveerde receptor wordt verwijderd uit een neuron. Model neuronen, vertegenwoordigd in de vorm van een reeks van differentiaalvergelijkingen, kan ook numeriek worden opgelost en laat de onderzoeker om kleine netwerken te onderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door MH084494 (CJL), en MH079276 en NS060658 (CAP).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | EGTA; Sigma-Aldrich | ||
MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus | ||
2 A/D converters | Equipment | e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A | ||
Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Company | ||
Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments | ||
Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
Monitor | Equipment | Triview |